Biosynthesis of C4 chemicals in Corynebacterium glutamicum via metabolic engineering

Abstract

1,4-Butanediol is an industrially important material serving as a key intermediate of plastics and chemicals. Microbial fermentation of 1,4-BDO production using metabolic-engineered bacterial strains has considerable potential as the alternative to fossil-fuel-based manufacturing of 1,4-BDO. Among the microbial pathway of 1,4-BDO, the CoA-independent pathway, using carboxylic acid reductase (CAR), is considered an effective biosynthetic route due to its simplicity of process and avoidance tendency of causing an intermediate acetyl-CoA loss. Here, the metabolic pathway of amino acid-producing strain Corynebacterium glutamicum was reconstructed by optimizing the production pool of two main intermediates of 1,4-BDO, succinate, and 4-hydroxybutyrate (4HB). By overexpressing phosphoenolpyruvate (PEP) carboxylase gene (ppc) from succinate producer strain Mannheimia succiniciproducens (Msppc), 33.97 g/L (0.23 g/g glucose) succinate was produced at 72 h fed-batch fermentation. A transcriptional regulator gene NCgl0275 was additionally expressed with Msppc for preventing end-product inhibition and growth rate reduction, achieving the concentration of 36.06 g/L (0.21 g/g glucose) with enhanced biomass accumulation and decreased byproduct formation. Based on the reconstructed succinate metabolic pathway, the 4HB biosynthesis pathway was introduced into the engineered strain. CGC3-MN1 strain, which carries succinyl-CoA synthase gene (ECsucCD), succinate semialdehyde dehydrogenase gene (SucD), succinic semialdehyde reductase gene (GOX1801), and aldehyde reductase gene (yqhD), produced 43.45 g/L 4HB (0.43 g/g glucose) during the 76 h batch fermentation. Finally, the CAR (MAB4714) operon is integrated into C. glutamicum strain CG4, creating CGC3 strain. During the fed-batch fermentation for 120 h, 4.28 g/L 1,4-BDO (0.023 g/g glucose) was accumulated from the CGC3 strain expressing 4HB production system. This study demonstrated the capability of C. glutamicum as a microbial cell factory of 1,4-BDO by utilizing various metabolic reconstruction and strain engineering strategies.;1,4-부탄디올은 플라스틱과 화학물질의 주요 중간체로써 역할을 하는 산업적으로 매우 중요한 물질이다. 대사공학 미생물 균주를 이용한 1,4-부탄디올 생산을 위한 미생물 발효는 화석 연료 기반의 1,4-부탄디올 제조의 대안으로써 상당한 잠재력을 갖는다. 미생물의 1,4-부탄디올 생산경로 중, 카르복실산 환원 효소 (CAR)를 이용한 CoA- 의존적 경로는 그 단순화된 과정과 중간체인 아세틸-CoA 손실을 방지할 수 있는 장점으로 인해 효과적인 생합성 경로로 여겨진다. 본 연구에서는 1,4-부탄디올의 두 가지 주요 중간체인 숙신산과 4-하이드록시뷰티르산 (4HB)의 생산량의 최적화를 통해 아미노산 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰의 대사 경로를 재구축하였다. 숙신산 생산 균주인 맨하이미아 숙시니키프로두켄스 유래 포스포엔올피루브산 카복시키네이스 유전자 (Msppc)를 과발현 하였을 때, 72시간 유가식 발효에서 33.97 g/L (0.23 g/g 글루코스)의 숙신산이 생산되었다. 최종 산물 저해와 생장 속도 저하 현상을 방지하기 위해 전사 조절 유전자 NCgl0275를 추가적으로 Msppc와 함께 발현시켜 36.06 g/L (0.21 g/g 글루코스)의 숙신산을 생산하였으며, 이 때 증가된 바이오매스 축적과 감소된 부산물 형성 양상을 확인하였다. 또한 숙신산 생산을 위해 재구축된 대사 회로를 바탕으로 4HB 생합성 경로가 개량 균주에 도입되었다. 숙시닐-CoA 합성효소 (ECsucCD), 숙신알데히드 탈수소효소 (SucD), 숙신알데히드 환원효소 (GOX1801), 알데히드 환원효소 (yqhD) 유전자를 보유한 CGC3-MN1균주를 이용하여 76시간 동안 유가식 발효를 진행하였을 때, 43.45 g/L (0.43 g/g 글루코스)의 4HB가 생산되었다. 최종적으로 CG4 균주에 CAR (MAB4714) 오페론이 삽입된 균주인 CGC3 균주가 개발되었다. 4HB 생산 시스템을 도입한 CGC3 균주를 이용한 120 시간의 유가식 발효에서 4.28 g/L (0.023 g/g 글루코스)의 1,4-부탄디올이 축적되었다. 이러한 결과를 바탕으로, 다양한 대사 회로 재구축 및 균주 개량 기법들을 통한 코리네박테리움 글루타미쿰의 1,4-부탄디올 생산을 위한 미생물 세포 공장으로의 활용 가능성이 제시되었다.