Blood DNA Methylation Signatures Induced by Diabetes Prevention Interventions

Abstract

Type 2 diabetes mellitus （T2DM） is a major global health burden, and the prevalence of individuals with both diabetes and obesity is rapidly increasing. Prediabetes represents an intermediate state in the progression to T2DM, during which weight management is particularly important for improving glycemic control and reducing the risk of T2DM progression. However, individual responses to weight management vary substantially, highlighting the need for molecular biomarkers that can detect intervention-related biological changes. DNA methylation is a promising epigenetic marker that can capture subtle molecular changes at the initial phases of disease, suggesting its utility in disease detection and prognostic assessment. Although numerous epigenome-wide association studies have reported DNA methylation markers associated with the development and progression of T2DM, methylation changes related to diabetes prevention interventions at prediabetes remain insufficiently understood. Therefore, this dissertation aimed to identify blood DNA methylation signatures associated with weight-loss response during early diabetes prevention interventions and to evaluate their biological relevance through cross-species translational analysis using a mouse model. To achieve this aim, two sequential studies focusing on the identification, biological characterization, and translational validation of blood DNA methylation signatures associated with weight-loss response during diabetes prevention interventions; [Study 1: Identification] Blood-based epigenetic signatures enable stratification of weight-loss responsiveness in individuals with prediabetes; [Study 2: Characterization and translational validation] Integrative human-mouse analysis of intervention-associated epigenetic alterations in a diet-induced obese mouse model. In Study 1, we analyzed 168 subjects （ages 30 to 70, BMI ≥ 23 kg/m2） from the Korean Diabetes Prevention Study （KDPS）, all with prediabetes. Participants underwent a 6-month intervention in three groups: standard management （STM）, intensive lifestyle modification （LSM） and metformin treatment （MET）. Blood samples collected at baseline and after 6 months of intervention were used, and the analysis primarily focused on weight-loss responsiveness. Individuals with a body weight reduction of at least 3% were classified as the 3% weight loss group （3%WL, n=85） and the weight gainer group （WG, n=53）. In addition, glycemic indicators improved across weight loss subgroups （1.6%, 3%, and 5%WL）, whereas such improvements were not observed in the WG group, supporting an association between weight loss and improved glycemic status. We developed a machine learning–based prediction model using baseline DNA methylation levels to identify individuals likely to respond to diabetes prevention interventions with weight loss. The model consisted of 62 CpG probes and 12 clinical factors. In an external validation cohort, because of differences in array platforms, 45 CpG probes overlapping with the model features, along with age and sex, were used to predict weight-loss response, showing an R2 of 0.52. To characterize biological changes associated with weight-loss response, differentially methylated regions （DMR） analysis was performed between the 3%WL and WG groups. A total of 365 DMRs, comprising 2,722 CpG probes mapped to 410 genes, were identified, with an overall hypomethylation pattern in the 3%WL group. Functional enrichment analysis implicated AMPK signaling and Wnt/calcium/cGMP signaling pathways, which are relevant to T2DM. Furthermore, to examine whether methylation changes in DMRs may be related to gene regulatory features, transcription factor （TF） motif analysis was performed using DMR probes located in active chromatin states. This analysis identified candidate TFs, including MAZ, WT1, and PATZ1, which are involved in adipogenesis and glucose metabolism. Collectively, Study 1 identified blood-based epigenetic signatures associated with weight-loss response during early diabetes prevention intervention in individuals with prediabetes. In Study 2, we established a KDPS-modeled mouse model using middle-aged female mice to investigate blood DNA methylation changes observed after the KDPS-modeled interventions. Human and mouse methylome datasets were further integrated to evaluate the cross-species concordance of blood DNA methylation signatures associated with weight-loss response at prediabetes. Diet-induced obese （DIO） mice were assigned to either a dietary reversal group （DIORe; switched from high-fat diet to normal diet） or metformin treatment group （DIOM; maintained on high-fat diet while receiving 150 mg/kg/day metformin treatment）. The DIORe group showed the most pronounced reduction in body weight and improvements in glucose tolerance and insulin sensitivity. In contrast, the DIOM group showed limited metabolic improvements, except for reduced LDL-cholesterol levels. To assess intervention-related epigenetic alterations, we analyzed blood DNA methylation profiles. Estimation of biological age using a mouse blood-based epigenetic clock showed reduced age acceleration in the DIORe group. In addition, DMR analysis revealed intervention-specific methylation alterations, with Wnt and calcium signaling prominently enriched in the DIORe group. Pathway analysis of DMR-associated genes showed significant enrichment of Wnt and calcium signaling pathways, which partially overlapped with the Wnt/calcium/cGMP signaling pathway identified in the KDPS. Based on these findings, integrative human–mouse analysis was performed to determine whether weight loss-associated methylation patterns identified in the KDPS were partially conserved in the mouse model. Although pathway-level analysis showed partial concordance in Wnt and calcium signaling between the human and mouse studies, the genes annotated to these pathways did not directly overlap. Therefore, the analysis was extended to the gene level by focusing on mouse orthologs of KDPS-derived pathway genes predicted to be regulated by candidate TFs. Representative genes, including PLCG1, ITPR3, RPTOR, HDAC4, and SMURF1, showed methylation patterns in the DIORe group that were similar to those observed in the KDPS 3%WL group. The expression of these genes was further examined in the liver and adipose tissue. Several genes showed expression patterns corresponding to blood methylation changes, and this tendency was observed more frequently in adipose tissue. Collectively, this dissertation identified blood DNA methylation signatures associated with weight-loss response after early diabetes prevention intervention at prediabetes. In particular, the identification of Wnt and calcium signaling suggests that weight-loss response may be associated not only with improvements in obesity and insulin resistance, but also with early molecular changes related to insulin secretion and pancreatic β-cell function before progression to diabetes. In addition, some DNA methylation signatures may partially reflect metabolic alterations in adipose tissue. Further longitudinal studies and methylation analyses in metabolic target tissues are needed to validate the utility of blood DNA methylation as a biomarker for precision diabetes prevention strategies.;2형 당뇨병은 전 세계적으로 주요한 공중보건 문제이며, 당뇨이면서 비만인 환자의 유병률 또한 가파르게 증가하고 있다. 당뇨병으로 진행되기 이전에 혈당 조절 이상 상태를 말하는 당뇨병전단계에서의 체중 관리는 2형 당뇨병으로의 진행을 지연시키거나 예방할 수 있다. 그러나 동일한 중재를 받더라도 체중 감소 반응에는 개인차가 있으며, 이를 반영할 수 있는 분자 마커로 DNA 메틸화가 주목된다. DNA 메틸화는 대표적인 후성유전학 마커로, 미세한 분자적 변화를 포착할 수 있어 질환의 탐지 및 예후 평가에 유용하다. 현재까지 2형 당뇨병의 발생 및 진행과 관련된 DNA 메틸화 마커에 대한 연구가 다수 보고되었으나, 당뇨병전단계에서 시행되는 예방 중재와 관련된 메틸화 변화는 충분히 규명되지 않았다. 따라서 본 연구에서는 초기 당뇨병 예방 중재에 따른 체중 감소 반응과 연관된 혈액 DNA 메틸화 시그니처를 탐색하고, 생쥐 모델 기반 DNA 메틸화 데이터를 활용한 종 간 중개연구를 통해 생물학적 관련성을 평가하고자 하였다. Study 1에서는 한국당뇨병예방연구 （Korean Diabetes Prevention Study, KDPS） 메틸롬 데이터를 활용하여, 6개월간 당뇨병 예방 중재를 받은 당뇨병전단계 대상자를 분석하였다. 대상자는 표준관리군（STM）, 생활습관개선군（LSM）, 메트포르민 복용군（MET）으로 구성되었으며, KDPS 중재 전과 6개월 후에 획득한 혈액 샘플을 활용하여 대상자들의 체중 감소 반응에 중점을 두었다. 중재 후 체중이 3% 이상 감소한 대상자를 3% 체중감소군（3%WL）, 체중이 증가한 대상자를 체중증가군（WG）으로 분류하였다. 체중 감소 정도에 따라 혈당 관련 지표를 비교한 결과, 당뇨병전단계 중재에서 체중 감소가 혈당 개선과 밀접하게 연관됨을 보였다. 또한 중재 전 DNA 메틸화 값을 이용하여 당뇨병 예방 중재 후 체중 감소에 반응할 대상자를 예측하는 머신러닝 기반 예측모델을 구축하였으며, 해당 모델은 62개의 CpG probe와 12개의 임상 지표로 구성되었다. 외부 검정 코호트에서는 본 모델의 예측 변수 중 공통으로 확인된 45개의 CpG probe와 나이, 성별을 이용하여 체중 감소 반응을 예측하였으며, R2 = 0.52의 예측 성능을 보였다. 체중 감소 반응과 연관된 생물학적 변화를 파악하기 위하여 3%WL군과 WG군 간 차등 메틸화 영역（differentially methylated regions, DMRs）을 분석하였고 365개의 DMR （2,722개 CpG probes / 410개 유전자）이 도출되었으며, 전반적으로 3%WL군에서 저메틸화 양상이 관찰되었다. DMR 유전자들에서 경로 분석을 진행한 결과, AMPK signaling 및 Wnt/calcium/cGMP signaling pathway 등이 도출되었고 이들은 2형 당뇨병과 연관성을 보이는 경로들이었다. 또한, DMR에서의 메틸화 변화가 실제 유전자 발현 조절과 관련이 있는지 확인하기 위하여 활성 크로마틴 상태와 관련된 DMR probe에서 전사인자 모티프 분석을 하였다. 그 결과, 지방세포 분화 및 포도당 대사와 관련된 MAZ, WT1, PATZ1 등의 후보 전사인자가 확인되었다. 결론적으로, 당뇨병전단계에서 당뇨 예방 중재 시 체중 감소 반응과 관련된 혈액 기반 후성유전학적 시그니처를 제시하였다. Study 2에서는 KDPS 중재 방식을 기반으로 설계한 중년 암컷 생쥐 모델을 구축하고 중재 후 관찰되는 혈액 DNA 메틸화 패턴을 분석하였다. 또한, 사람과 마우스의 메틸롬 데이터를 통합하여, 당뇨병전단계에서 체중 감소 반응과 관련된 혈액 DNA 메틸화 시그니처의 종 간 일치성을 평가하였다. 고지방 식이 유도 비만 생쥐 모델은 고지방식이에서 정상식이로 전환한 식이전환군（DIORe）과 메트포르민 투여군（DIOM）으로 분류되었다. DIORe군은 체중 감소, 포도당 내성 및 인슐린 민감성 개선이 가장 뚜렷하게 나타났으며, DIOM군에서는 LDL 콜레스테롤 감소가 관찰되었으나, 체중 감소나 당대사적 개선은 제한적이었다. 이어 중재방식에 따른 후성유전학적 변화를 평가하기 위하여 혈액 DNA 메틸화 프로파일을 분석하였다. 마우스 혈액 기반 후성유전 시계에서 생물학적 나이를 추정한 결과, DIORe군에서 노화 가속화의 감소가 나타났다. 또한, 체중 감소와 관련된 메틸화 차이를 확인하기 위하여 DIO와 DIORe군에서 DMR 분석을 수행하였다. 도출된 DMR 유전자에서 경로 분석을 한 결과, Wnt 및 calcium signaling pathway가 유의하게 도출되었으며, 이는 KDPS 연구에서 확인된 체중 감소 관련 경로인 Wnt/calcium/cGMP signaling pathway와 부분적으로 일치하였다. 이를 바탕으로 KDPS에서 도출된 체중 감소 관련 메틸화 패턴이 마우스에서도 보존되는지 확인하기 위하여 사람과 마우스의 메틸롬 데이터에서 통합 분석을 하였다. 경로 수준 분석에서 Wnt 및 calcium signaling pathway가 부분적으로 일치하였으나, 해당 경로에 포함된 유전자들이 직접적으로 중복되지는 않았다. 이에 KDPS에서 도출된 경로 관련 유전자 중 후보 전사인자에 의해 조절될 것으로 예측되는 유전자의 마우스 상동유전자를 중심으로 비교한 결과, PLCG1, ITPR3, RPTOR, HDAC4, SMURF1 등이 DIORe군에서 KDPS 3%WL군과 유사한 메틸화 패턴을 보였다. 또한 간과 지방조직에서 해당 유전자들의 발현을 분석한 결과, 일부 유전자에서 혈액 메틸화 변화와 상응하는 발현 양상을 보였으며, 이러한 경향은 지방조직에서 더 자주 관찰되었다. 종합하면, 본 연구는 당뇨병전단계에서 초기 당뇨병 예방 중재 후 체중 감소 반응과 관련된 혈액 DNA 메틸화 시그니처를 제시하였다. 특히, Wnt 및 calcium signaling pathway의 도출은 당뇨병전단계에서의 체중 감소 반응이 비만 및 인슐린 저항성 관련 대사 개선뿐만 아니라 인슐린 분비와 췌장 β세포 기능에 관련된 초기 분자적 변화와도 연관될 수 있음을 시사하였다. 또한 일부 DNA 메틸화 시그니처는 지방조직의 대사적 변화를 부분적으로 반영할 가능성을 보였다. 향후 장기 추적 연구 및 조직 간 메틸화 비교 분석을 통해 혈액 DNA 메틸화 바이오마커로서의 유용성을 검증할 필요가 있다.