Engineering of Enzymes and Whole-Cell Biocatalysts for the Production of High-Value Chemicals from C1 to C18 Carbon Compounds

Abstract

Enzyme and whole-cell biocatalyst engineering offer sustainable routes for converting renewable carbon compounds into high-value chemicals under mild reaction conditions. This research addresses three distinct catalytic challenges across a C1 to C18 substrate range: selective C–C bond formation from one-carbon aldehydes, terminal oxyfunctionalization of aliphatic methyl esters, and cascade conversion of polyunsaturated fatty acids into volatile aldehydes. The first study engineered two thiamine diphosphate-dependent carboligases for the regioselective conversion of formaldehyde into C4 erythrulose without C3 dihydroxyacetone formation. Structure- guided engineering of glyoxylate carboligase from Escherichia coli （EcGCL） and a C2 carboligase from Vibrio vulnificus （VvSucA） targeted residues involved in aldehyde interaction and substrate access. The optimized EcGCL–VvSucA pair produced 8 mM erythrulose from 90 mM formaldehyde with no detectable dihydroxyacetone, and structural comparison of the ThDP-adjacent cavity suggested that active-site spatial compatibility underlies selective C4 product formation. The second study investigated the substrate scope and stereoselectivity of membrane-bound alkane monooxygenase （AlkB） from Marinobacter sp. and other microbial origins toward linear and branched aliphatic esters. Literature-guided mutagenesis targeting the active site, tunnel entrance, and transmembrane domain yielded substrate-dependent and in some cases counterintuitive outcomes. For branched substrates, the ester or acetate moiety blocked the preferred linear hydroxylation site, redirecting oxidation to the prochiral gem-dimethyl center, representing the first demonstration of stereoselectivity in AlkB with （R）-selectivity and establishing a route to chiral building blocks difficult to access by conventional asymmetric synthesis. However, stereoselectivity varied with substrate structure and mutation and resisted straightforward interpretation, suggesting that the catalytic behavior of this integral membrane enzyme is governed not only by active-site geometry but also by interactions with the membrane environment. The third study developed an E. coli-based lipoxygenase （LOX）–hydroperoxide lyase （HPL） cascade xivfor hexanal biosynthesis from linoleic acid. LOX from Pseudomonas aeruginosa （PaLOX） was paired with plant-derived and bacterial HPL candidates, and insufficient functional expression of HPLs in E. coli was improved by fusion with maltose-binding protein （MBP）. Periplasmic localization of PaLOX, combined with single-cell co-expression of MBP-fused HPL, produced up to 2.7 mM hexanal （30.7 U/gCDW） from 5 mM linoleic acid, establishing a whole-cell platform for biocatalytic flavoring aldehyde production. Together, these studies demonstrate that unlocking the full catalytic potential of biocatalysts demands a holistic engineering perspective in which enzyme-level and whole-cell-level interventions are treated as interdependent rather than isolated variables. This integrated approach, applied across a C1 to C18 substrate range, provides a generalizable framework for engineering selective and productive biotransformation systems from renewable carbon sources.;효소 및 전세포 생촉매 공학은 재생 가능한 탄소 화합물을 온화한 조건에서 고부가가 치 화학물질로 전환할 수 있는 지속 가능한 생산 전략이다. 본 연구는 C1에서 C18에 이르는 폭넓은 탄소 기질을 대상으로, 기질 구조와 반응 특성에 적합한 효소 및 전세포 생촉매 공학 전략을 제시하였다. 구체적으로 단일 탄소 알데히드로부터의 선택적 C–C 결합 형성, 지방산 메틸 에스터의 말단 산소 작용기화, 다중불포화 지방산의 휘발성 알 데히드 전환이라는 세 가지 촉매 과제를 다루었다. 첫 번째 연구에서는 포름알데히드로부터 C4 화합물인 에리스룰로스를 위치선택적으로 생산하기 위해 두 종의 티아민 이인산（ThDP） 의존성 탄소 결합 효소를 개량하였다. 기 존 포름알데히드 전환 시스템에서 흔히 발생할 수 있는 C3 부산물인 디하이드록시아세 톤 형성을 배제하고, C4 산물을 고효율로 생산하는 것을 목표로 하였다. 이를 위해 Escherichia coli 유래 글리옥실레이트 카볼리가아제 （EcGCL）와 Vibrio vulnificus 유래 C2 카볼리가아제 （VvSucA）를 조합하였다. EcGCL에서는 알데히드 반응성과 기질 접근에 관 여할 수 있는 잔기를 대상으로 구조 기반 개량을 수행하였고, VvSucA에는 글리콜알데히 드 전환 효율을 높이기 위한 변이를 도입하였다. 그 결과, 최적화된 EcGCL–VvSucA 조 합은 90 mM 포름알데히드로부터 C3 부산물 없이 8 mM 에리스룰로스를 생산하였다. 이 는 단일 탄소 알데히드를 출발 물질로 사용하여 C4 화합물을 선택적으로 합성할 수 있 는 새로운 생촉매 연속 반응의 가능성을 보여준다. 두 번째 연구에서는 막결합형 알케인 모노옥시게나제인 AlkB를 이용하여 선형 및 분 지형 지방산 에스터의 산소 작용기화를 수행하였다. AlkB는 소수성 기질의 말단 수산화 에 유용한 효소이지만, 막관통 단백질이라는 특성 때문에 기질 접근 경로와 선택성 제 어 원리가 충분히 밝혀져 있지 않다. 본 연구에서는 Marinobacter sp. 유래 AlkB를 포함 한 여러 미생물 유래 AlkB 상동 효소를 비교하고, 활성 부위, 기질 터널 입구, 막관통 도메인에 위치한 잔기의 변이 효과를 분석하였다. 특히 분지형 지방산 에스터에서는 에 201스터 또는 아세테이트기가 선형 말단의 수산화를 제한하고, gem-디메틸기를 포함하는 프 로키랄 중심에서 선택적인 산소화가 유도되는 것을 확인하였다. 이를 통해 AlkB가 단순 한 말단 수산화 효소를 넘어, 분지형 기질의 입체선택적 산소 작용기화에도 활용될 수 있음을 제시하였다. 또한 생성물에서 R-선택성이 관찰되어, AlkB 기반 반응이 키랄 빌딩 블록 생산으로 확장될 가능성을 보여주었다. 다만 기질 구조와 변이에 따라 입체선택성 이 달라졌으며, 이는 AlkB의 촉매 거동이 활성 부위뿐만 아니라 기질 터널, 막관통 영 역, 막 환경에서의 기질 배향에 의해 함께 조절됨을 시사한다. 세 번째 연구에서는 리놀레산으로부터 천연 향미 알데히드인 헥사날을 생합성하기 위 해 E. coli 기반 리폭시게나제 （LOX）–하이드로퍼옥사이드 분해효소 （HPL） 전세포 시스템 을 구축하였다. LOX와 HPL은 리놀레산을 중간체인 하이드로퍼록시 지방산을 거쳐 헥사 날로 전환할 수 있지만, HPL의 낮은 기능적 발현과 연속 반응 내 중간체 균형 조절이 주요 한계로 작용하였다. 본 연구에서는 Pseudomonas aeruginosa 유래 LOX （PaLOX）와 식 물 및 세균 유래 HPL 후보군을 조합하여 전세포 반응성을 비교하였고, HPL의 기능적 발현을 개선하기 위해 말토스 결합 단백질 （MBP） 융합을 적용하였다. 특히 PaLOX의 주변세포질 （periplasm） 국소화와 MBP 융합 HPL의 단일 세포 내 공동 발현을 조합함으 로써, 5 mM 리놀레산으로부터 최대 2.7 mM 헥사날 （30.7 U/gCDW）을 생산하였다. 이는 E. coli 전세포 플랫폼에서 LOX–HPL 연속 반응을 구현하고, 지방산으로부터 휘발성 향미 알데히드를 생산할 수 있음을 보여준다. 종합적으로, 본 연구는 C1 알데히드, 중쇄 지방산 에스터, C18 다중불포화 지방산이라 는 서로 다른 기질군에 대해 각 반응 특성에 맞춘 생촉매 공학 전략을 제시하였다. 특 히 활성 부위 개량에 국한하지 않고, 이합체 계면 （dimer interface）, 막관통 영역 （transmembrane domain）, 세포 내 발현 위치, 융합 태그, 시스템 내 중간체 균형과 같은 요소를 함께 고려하여 생촉매 성능을 향상시켰다. 이러한 결과는 재생 가능한 탄소 자 원으로부터 선택적이고 생산적인 생물전환 시스템을 설계하기 위해 효소 구조, 기질 반 응성, 세포 내 환경을 통합적으로 고려해야 함을 보여준다.