AMPK-mediated effects of caffeine on circadian clock genes in fibroblasts

Abstract

Caffeine is one of the most widely consumed psychoactive substances and is known to disrupt circadian rhythm. However, the molecular mechanisms by which it modulates peripheral clocks remain incompletely understood. Circadian rhythms are generated by cell-autonomous transcriptional–translational feedback loops (TTFLs) with an approximately 24-hour period, and the central clock located in the hypothalamus coordinates peripheral clocks distributed across multiple organs and tissues. Although peripheral clocks are synchronized under the influence of the central clock, they can maintain intrinsic rhythmicity even in the absence of input from the central clock. Moreover, peripheral clocks can respond to metabolic perturbations, including those induced by compounds such as caffeine, in a tissue-specific manner, rendering them particularly susceptible to disruption. In this study, we investigated how caffeine and its endogenous counterpart adenosine modulate peripheral clocks in an in vitro model and sought to define the pathways through which these effects are mediated. Using NIH/3T3 fibroblasts as a peripheral clock model, circadian outputs were assessed through a PER2 promoter luciferase reporter system containing either a wild-type E-box (WT) or a mutated E-box (MUT) plasmids through real-time bioluminescence recording, and quantitative real-time PCR profiling of core clock genes and clock-controlled genes over a 48-hour after caffeine and adenosine exposure. To interrogate adenosine signaling routes, selective inhibitors targeting adenosine receptors (ADORA2A and ADORA2B) and adenosine transport pathway (ENT1 and ADK) were applied. AMPK activity was quantified by kinase assay, and AMPK dependency was tested by pharmacological inhibition with Compound C. In addition, Arntl knockdown was used to probe the contribution of the core transcriptional loop, and untargeted LC–MS/MS metabolomics was performed to profile treatment-associated metabolic signatures. Caffeine altered PER2 reporter bioluminescence in NIH/3T3 cells, however, this effect was not explained by direct modulation of cAMP-PKA-CREB pathway or E-box–dependent transcription, as WT–MUT differences emerged primarily under CLOCK:BMAL1 overexpression conditions rather than under caffeine treatment alone. Consistently, single treatments with caffeine or adenosine produced limited and non-robust changes in rhythmic mRNA expression patterns of multiple clock genes across 48 hours, and blocking ADORA2A/ADORA2B or adenosine transporter-related pathways did not markedly shift Per2 and Clock mRNA responses under these conditions. In contrast, both caffeine and adenosine increased AMPK activity, with adenosine showing a stronger overall induction. Also, we found that AMPK activity decreased when adenosine influx was blocked through the transporter pathway. Together, these results suggest that AMPK activation depends in part on transporter- and ADK-linked intracellular adenosine handling. Direct AMPK inhibition altered circadian gene expression dynamics, enhancing or dampening oscillatory patterns in a gene-dependent manner and modifying the response to caffeine and adenosine, supporting AMPK as a central node connecting these treatments to peripheral clock regulation. Metabolomic profiling revealed only a few significantly altered metabolites in the caffeine and adenosine groups, including pathway-associated changes involving phenylalanine-related metabolism, whereas AMPK inhibition produced a broader shift that included metabolites mapping to arginine and proline metabolism. Together, these findings indicated that caffeine could modulate peripheral circadian outputs in fibroblasts potentially through AMPK activation. Moreover, caffeine-induced AMPK activation appeared to involve, at least in part, ADORA2B blockade and transporter-mediated intracellular adenosine handling. However, further studies are required to delineate the precise molecular hierarchy linking adenosine receptor signaling, intracellular adenosine metabolism, and AMPK activation, and to determine whether AMPK directly affects PER2 protein stability and whether higher-dose treatments elicit distinct changes in circadian rhythms. In addition, it will be important to assess whether these mechanisms operate similarly across different peripheral tissues and in vivo contexts.;카페인은 가장 널리 섭취되는 향정신성 물질 중 하나로 일주기 리듬을 교란하는 것으로 알려져 있으나, 말초 시계를 조절하는 분자 기전은 아직 충분히 규명되지 않았다. 일주기 리듬은 세포 자율적 전사–번역 피드백 루프에 의해 약 24시간 주기를 가지게 되며, 시상하부에 존재하는 중심시계가 여러 장기나 조직에 분포하는 말초시계들을 조정함으로써 기능한다. 더욱이 말초 시계들은 이러한 중심시계의 영향을 통해 모두가 동일한 주기로 기능하고 있지만, 중심시계의 입력이 없어도 그 들 자체적인 리듬을 유지할 수 있다. 더욱이 말초시계들은 카페인과 같은 대사 물질을 통해 발생한 변화에는 조직 특이적으로 특히 민감하게 반응해 시계에 교란이 일어날 수 있다. 본 연구는 생체 외 연구에서 카페인과 내인성 대응 물질인 아데노신이 말초 시계를 어떻게 조절하는가에 대해 탐구하고 어떤 기전을 통해 변동시키는지 규명하고자 하였다. PER2의 실시간 생물발광을 측정하였을 때, 카페인은 NIH/3T3 세포에서 PER2의 발현을 증가시켰다. 플라스미드 간 E-box 서열 돌연변이의 차이가 있음에도 불구하고 두 군 간 발현 차이가 없는 것을 미루어 보아 E-box를 통한 CLOCK:BMAL1의 영향에서도 카페인이 독립적으로 생체시계를 변화시키는 것으로 생각된다. 이에 더해, 아데노신과 카페인은 48시간 동안 여러 시계 유전자의 mRNA 발현 패턴에 있어 큰 변화를 유도하지 못해, 카페인을 통한 일주기 리듬의 변동은 mRNA 수준의 변동으로는 설명되지 않는 것으로 보인다. 카페인이 어떤 경로를 통해 일주기 리듬을 변동시키는지 알아보기 위해, 카페인이 아데노신의 길항효과를 보이는 것으로 잘 알려진 ADORA 경로와 직접 아데노신을 세포내로 이동시키는 수송체의 두 가지 경로를 살펴보았다. 결과적으로는 ADORA 또는 수송체 관련 경로를 억제하더라도 해당 조건에서 Per2 및 Clock mRNA 반응이 뚜렷하게 변하지는 않았다. 마지막으로 이 두 가지 경로의 공통된 경로인 AMPK를 살펴보았을 때, 아데노신과 카페인은 모두 AMPK 활성을 증가시켰고, 전체적으로는 아데노신의 유도 효과가 더 강했다. 이와 함께 ADORA와 수송체 경로를 억제했을 때에는 아데노신 수송체 경로와 세포내 아데노신 인산화 경로를 차단했을 때 AMPK 활성이 감소하는 등, AMPK 활성화에 수송체 연계 기전이 중요한 역할을 할 가능성이 나타났다. 다음으로 AMPK를 직접 억제 후 시계 유전자의 mRNA를 확인해 보았을때는 유전자마다 진동 양상이 강화되거나 약화되는 등 유전자 발현 양상의 변화가 관찰되었다. AMPK 억제시에는 아데노신 및 카페인에 대한 mRNA 반응도 달라져, AMPK가 이들 처리와 말초 시계 조절을 연결하는 핵심임을 뒷받침하였다. 대사체 분석에서는 아데노신 및 카페인군에서 유의하게 변한 대사체가 소수 확인되었으며, 이 중 페닐알라닌 관련 대사 경로와 연관된 변화가 포함되었다. 반대로 AMPK 억제 조건에서는 조금 더 많은 수의 대사체 변화가 관찰되었으며, 아르기닌과 프롤린 대사 경로에 속하는 대사체 변화 또한 관찰되었다. 본 연구에서 PER2 reporter 시스템으로 카페인의 효과를 평가했을 때, E-box 변이 여부와 무관하게 PER2 리포터 출력이 증가했으며, 또한 본 리포터 구성체에는 정형적인 CRE 서열이 포함되어 있지 않았다. 일반적으로 cAMP 상승은 PKA 활성화와 CREB 인산화를 유도하고, 인산화된 CREB가 Per2 프로모터의 CRE 서열에 결합하여 Per2 전사를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 그러나 본 연구에서 사용한 형질전환 플라스미드에는 CRE 서열이 없었음에도 카페인에 의해 리포터 출력이 증가했으므로, 카페인의 효과를 CREB의 직접적인 CRE 결합만으로 설명하기는 어렵다. 이러한 결과는 Per2 프로모터 내에서 E-box 및 CRE 이외의 다른 조절 서열(또는 전사 외 조절 층위)이 카페인에 의한 분자적 변화를 매개했을 가능성을 시사한다. 또한 본 실험은 Per2 프로모터에 연결된 발광 신호만을 측정했기 때문에, AMPK가 실제 PER2 단백질의 안정성에 관여하는지에 대해서는 향후 AMPK가 실제 PER2 단백질 안정성을 조절하는가에 관한 추가 연구가 필요하다. 마지막으로, 기존 문헌에서 차용한 처리 농도는 단백질 수준 변화에는 충분했을 수 있으나 mRNA 수준 변화는 유도하지 못했을 가능성이 있어, 보다 고농도 조건 및 in vivo 모델을 포함하지 못한 점이 본 연구의 한계로 남는다. 종합하면, 본 결과는 카페인이 섬유아세포에서 말초 시계를 조절할 수 있음을 보여주며, 그 기전은 정형화된 E-box 전사 조절에 주로 의존하기보다는 AMPK 연관 신호 및 대사 재구성과 더 밀접하게 관련됨을 시사한다. 또한 이러한 과정에 아데노신 수송체를 매개하여 관여할 가능성을 제시하며, 카페인 및 아데노신 기반 말초 일주기 조절의 핵심 기여 경로로 AMPK 축을 강조한다.