Application of a Bacteriophage VPG01 for Biological Control of Vibrio parahaemolyticus in Food and Cutting board

Abstract

Vibrio parahaemolyticus is one of the seafood borne pathogens causing gastroenteritis accompanied by diarrhea and fever through the consumption of contaminated food. Also, it results in vibriosis to the sea animals, causing the abnormal morality of animals and substantial economic damages to the aquaculture industry. Though antibiotics were the most effective chemical agents to control Vibrio species, the abuse and misuse of antibiotics have caused the emergence of multidrug-resistant strains throughout the world. Therefore, eco-friendly agents for controlling pathogens have been advised for the prevention of microorganism contamination in foods, like the bacteriophages. In this study, V. parahaemolyticus-infecting bacteriophage VPG01 was newly isolated from domestic oysters and characterized for proving its potential. Morphologically, VPG01 belongs to the family of Siphoviridae having an icosahedral head (90.6nm) with a flexible tail (156.2nm). Results of the host range determination, VPG01 should highly infect to V. parahaemolyticus ATCC 33844 and V. parahaemolyticus FORC_023 strains. The phage VPG01 was quickly absorbed into the host bacterial cells. About 72% of the phage was attached to the host cells within 9 min. Also, one-step growth curve showed that an eclipse period is 15 min, a latent period is 20 min, and a burst size is 350 pfu per infected cell. VPG01 should endure thermal stress from 4℃ to 50℃. Also, the pH stability test showed that VPG01 was stable between pH 4 and pH 11. Bacterial challenge assay was executed with V. parahaemolyticus ATCC 33844 at a multiplicity of infection (MOI) of 0.01, 0.1, and 1. MOIs-dependent growth inhibition was observed, suggesting a possibility of VPG01 as an alternative control agent. The phage cocktail treatments composed of VPG01 and VPT02, a different phage previously characterized, also work to moderate the growth curve of host bacterial cells. Although no additive and synergistic effect were observed, and even the inhibition graph line was similar with the VPG01 single treatment. This phenomenon suggests that two separate phages may share similar host receptor mechanisms and that VPG01 surpasses VPT02. To the successful application of the phage cocktail, the phage-phage interaction needs to be further studied. For survival test with the brine shrimp model, hatched brine shrimps were infected with V. parahaemolyticus FORC_023 and then treated with phage VPG01. When the VPG01 was treated at an MOI of 10, half of the whole brine shrimp was still alive after 50 h. It shows that VPG01 has the efficacy of phage therapy in the brine shrimp in vivo model. In a food application test, VPG01 at an MOI of 10 showed that 1.63-log reduction at 4 h and a not detection of bacteria after a 6 h incubation at the room temperature in the sliced raw fishes spiked with V. parahaemolyticus FORC_023. Also, in the case of kitchenware application, VPG01 at an MOI of 1000 demonstrated a 3-log reduction after 3 h incubation in the cutting board. From these results, VPG01 could be a good biocontrol agent against V. parahaemolyticus strains in the kind of fields like the food and marine industries. ;장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus)는 오염된 해산물을 섭취한 사람에게 설사와 열을 동반하는 위장염을 유발하는 해산물 매개 병원균 중 하나이다. 또한 이 병원균은 해양 생물에게 비브리오증 (vibriosis)을 일으켜 생물의 비정상적인 죽음과 양식 산업에 막대한 경제적 손실을 유발한다. 비록 많은 항생제가 이 병원성 균을 억제하는 데 효율적이지만, 항생제 남용 및 오용은 전 세계에 다중약물내성 미생물의 출현을 유발한다. 그러므로, 식품 내 미생물 오염을 막기 위해 박테리오파지와 같은 병원균을 제어하는 친환경적인 대체재가 고안되어오고 있다. 본 연구에서는, 장염 비브리오를 특이적으로 감염하는 박테리오파지 VPG01을 굴에서 새롭게 분리하였고 잠재성을 증명하기 위해 특징을 분석하였다. 형태학적 분석을 통해, VPG01이 정이십면체의 머리와 신축성 있는 꼬리를 갖는 Siphoviridae family에 속한다는 것을 파악하였다. 숙주 범위를 분석한 결과, 이 파지는 V. parahaemolyticus ATCC 33844와 V. parahaemolyticus FORC_023에 매우 잘 감염한다는 것을 밝혔다. 파지 VPG01은 매우 빠르게 숙주 세균 세포에 부착하였다. 9분 만에 약 72%의 VPG01가 흡착하였다. 또한, 이 파지의 암흑기는 15분, 잠복 기간은 20분, 그리고 방출량은 350 PFU/infected cell로 나타났다. 그리고 VPG01은 4℃부터 50℃까지의 열에서 견딜 수 있다. 또한, pH 4부터 pH 11까지 pH 안정성이 확인되었다. V. parahaemolyticus ATCC 33844에 VPG01의 감염다중도를 0.01, 0.1, 그리고 1으로 처리하였다. 그 결과, 장염 비브리오의 성장이 감염다중도에 의존적으로 억제되는 것이 관찰되었다. 이를 통해 장염비브리오에 대한 대안적 조절제로서의 잠재성을 확인하였다. 또한, 이전에 분리되었던 다른 파지인 VPT02와 VPG01로 구성된 파지 칵테일의 처리에서도 숙주 세포의 성장 억제 효과를 관찰할 수 있었다. 비록 상가효과와 상승효과는 관찰되지 않았지만 숙주 세포 성장을 억제하는 유형이 VPG01 단일 처리와 거의 유사하다는 것을 확인하였다. 이 현상은 서로 다른 파지인 VPG01과 VPT02가 감염에 필요한 수용체 같은 숙주 세포 감염 체계를 유사한 기작으로 공유할 것이라는 점과 숙주를 감염하는 조건에서 VPG01이 VPT02를 능가한다는 것을 뒷받침한다. 다양한 산업 영역에서 파지 칵테일의 성공적인 적용을 위해 파지의 상호작용에 관한 추가적인 연구가 필요하다. 생존 실험을 위해 브라인 새우 모델이 사용되었는데, 부화한 브라인 새우는 V. parahaemolyticus FORC_023으로 감염한 후 파지 VPG01을 처리하였다. 감염다중도를 10으로 처리하였을 때, 50시간이 지나도 전체 브라인 새우 중에서 절반이 여전히 살아남았다. 식품 적용 실험에서, V. parahaemolyticus FORC_023을 처리한 생선회에 VPG01의 감염다중도를 10으로 처리하여 상온에서 배양한 지 6시간이 되었을 때 세균이 전혀 검출되지 않았다. 또한, 주방용품 적용 실험에서는 VPG01을 감염다중도 1000으로 처리하였을 때 3시간 뒤 도마에서 3 로그만큼 감소하는 것이 확인되었다. 이 결과를 통해, 이 연구에서는 VPG01이 Vibrio parahaemolyticus을 억제하는 훌륭한 생물학적 작용제로 적용될 가능성이 충분하다고 밝혔다.