3T3-L1 세포에서 폴리페놀의 지방세포 분화 억제 능력과 커큐민의 생체 이용률 평가

Abstract

‘체내에 과다하게 체지방이 쌓인 상태’ 로 정의할 수 있는 비만은 독립적 혹은 다른 여러가지 질환과 관련이 되어 건강과 관련된 문제를 야기시킨다. 특히 암, 제2형 당뇨병, 고혈압, 골 관절염, 심혈관계 질환 등 많은 만성질환을 유발할 수 있는 원인으로 지목되고 있다. 비만의 원인에는 여러가지가 있을 수 있으나 과다한 에너지 섭취와 지방세포의 과도한 분화, 신체활동의 부족 등과 같은 에너지 섭취량과 소비량 간의 불균형이 오랫동안 지속되어 나타나는 지방조직의 축적현상이 비만을 야기하는 주된 원인이라고 할 수 있다. 본 연구에서는 비만을 예방하기 위해 섭취해야 하는 식품의 물질 중 하나인 폴리페놀 화합물의 지방세포 분화억제 효과와 그 생체 이용률에 초점을 두었다. 식물성 생리활성물질인 폴리페놀 화합물들이 지방세포의 분화를 얼마나 억제하는지 화합물 별로 비교하고자 Oil Red O 염색을 실시하였으며, Oil red O 염색 결과와 비교 해보기 위해 지방세포가 분화되면서 배양액에 분비되는 렙틴의 양도 ELISA를 수행하여 측정, 둘의 상관관계도 함께 관찰하였다. Oil red O 염색과 배양액의 렙틴 농도 측정을 통해서 알게 된, 지방 분화 억제 효과에 가장 큰 효능을 보여주었던 커큐민을 선택하여 3T3-L1 세포가 커큐민을 얼만큼 잘 흡수하는지를 알아보고자 농도 별, 시간 별로 커큐민을 처리한 뒤 세포를 용해하여 HPLC 분석을 실시하였으며, 세포 이외에 배양액에서도 커큐민 농도의 변화를 알아보기 위해 배양액을 수집하여 분석하였다. 또한 세포 내 커큐민 축적 여부를 알아보기 위해 커큐민을 분화과정동안 반복적으로 처리해준 뒤 분화 13 일째 세포를 용해시켜 분석하였다. 실험 결과, Oil red O 염색에서 6 가지 화합물을 처리했을 때 커큐민, 퀘르세틴, 그리고 레스베라트롤 세 가지의 화합물이 10 μM, 20 μM 두 농도에서 대조군 비교 시 모두 유의적 차이를 보여 지방세포의 분화를 억제시키는 것을 알아낼 수 있었다. 세포가 분비한 배양액 내의 렙틴을 ELISA로 측정한 결과, Oil red O 염색의 결과와 마찬가지로 커큐민, 퀘르세틴, 레스베라트롤이 역시 대조군 비교 시 렙틴 분비량이 유의적으로 낮음을 관찰하였다. Oil red O 염색의 흡광도 값과 렙틴의 분비량을 비교해 보았을 때 둘은 상당히 일치하는 높은 상관계수를 보여주었다. 세포의 커큐민 흡수율을 알아보기 위해 농도 별과 시간 대 별로 처리하여 분석한 결과, 커큐민 처리 2 시간 후가 가장 세포 내 커큐민의 농도가 높게 검출되어 2 시간 대에 흡수를 가장 많이 한다는 사실을 알 수 있었다. 배양액 내의 커큐민은 처리 이후로 배양시간이 길어질수록 계속해서 감소하여 배양액 내에 오래 머물지 않고 빠르게 분해되는 것을 관찰하였다. 또한 3T3-L1 지방 전구세포를 지방세포로 분화시키며 커큐민을 반복적으로 처리했을 때, 커큐민의 축적이 이루어지는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통해 실험에 이용된 폴리페놀 화합물 중 커큐민, 퀘르세틴, 레스베라트롤은 20 μM 뿐만 아니라 생체 내 최대한으로 도달할 수 있는 농도에 가까운 10 μM에서도 지방분화의 억제에 유의적인 효과를 보여주어 식품 섭취를 통해 비만을 예방할 수 있는 항 비만제로서의 가능성을 보여주고 있으며, 각 화합물 처리 별 Oil red O 흡광도 값을 통해 살펴본 세포의 분화정도와 렙틴의 분비량을 비교하였을 때 둘은 높은 상관계수를 보여주어, 폴리페놀 화합물에 의해 지방세포의 분화가 억제되면 렙틴의 분비 또한 그만큼 적어진다는 사실을 확인할 수 있었다. 또한 화합물 중 가장 뛰어난 지방 분화 억제 효과를 보여주었던 커큐민은 세포에 처리 시 각 농도 별로 2시간 때 가장 높은 흡수율을 보여주었고 그 이상 배양하였을 때 농도가 점점 감소하여 24 시간부터는 완전히 검출이 되지 않았다. 하지만 선행 임상연구에서 8 g의 커큐민을 하루 섭취하고 혈액 내 농도를 분석했을 때에는 검출이 되지 않았지만, 3개월 간 매일 8 g씩 섭취했을 때 1.77 ± 1.87 μM 농도의 커큐민이 검출되어, 반복적인 섭취에 대한 효과를 보여주었다. 본 연구에서도 분화과정 중 한 번의 처리는 축적이 되지 않지만, 반복적으로 처리했을 때 5 μM 처리 시 0.22 ± 0.0001 μM, 10 μM 처리 시 0.57 ± 0.29 μM의 축적된 커큐민을 확인할 수 있었으며, 이는 반복적인 식품 중 커큐민 섭취가 지방세포 내에 축적이 되어 지방세포 분화의 억제에 효과를 줄 수 있음을 시사한다. ;Today, obesity has become a serious health problem worldwide. Obesity is associated with many other diseases and causes problem with health. It can cause many chronic diseases, especially cancer, type 2 diabetes, hypertension, osteoarthritis and cardiovascular disease. There are many different reasons but the main causes of obesity are the accumulation of fat tissues, excessive differentiation of adipocytes, lack of physical activity, etc., and the prolonged imbalance between energy intake and energy expenditure. It is also related to mental aspects such as individual attitudes and depression, so it is very important to prevent and treat obesity. So, as a way to prevent obesity, which is now a major health problem around the world, there has been a lot of research on prevention using phytochemicals, especially polyphenol compounds. In this study, six polyphenol compounds were selected which are known to be effective for various diseases and compared their ability of inhibiting 3T3-L1 adipocyte differentiation. Then, selected the most effective compound and evaluated its bioavailability using 3T3-L1 in vitro models. For the experiment, each polyphenol compounds were treated once on 3T3-L1 cells with a concentration of 10 μM and 20 μM during differentiation process. At the end of the differentiation days, cells were dyed with Oil red O solution and extracted with 100% isopropyl alcohol. And the media derived from 24-well for the Oil red O dying was used in ELISA test to identify leptin levels. Also, for the test of the bioavailability, treated compound with 0, 2,5, 5, 10, 20, 40 μM on 3T3-L1 cells and incubated 0, 1, 2, 4, 8, 24 hours. Cells of each conditions were analyzed by HPLC. Based on the Oil red O staining, 3 compounds, curcumin, quercetin, resveratrol, showed inhibitory effect at the concentration of 10 μM treatment as well as the concentration of 20 μM treatment. The rest of the compounds, apigienin, chlorogenic acid, epigallocatechin gallate, was not showed inhibitory effect of differentiation in both concentrations. The results of the leptin ELISA showed the same tendency as the result of Oil red O staining, which showed that the more cell differentiation is suppressed, the lower leptin concentration in the media was detected. In other words, a much lower concentration of leptin was detected in the media of cells treated with curcumin, quercetin and resveratrol than those treated with other compounds. This means that the three compounds prevent the differentiation of 3T3-L1 cells and reduce the secretion of leptin. In particular, among the three compounds, curcumin showed the highest inhibitory effect. So, curcumin was adopted for the bioavailability test. By the HPLC analysis, the best incubation time that cells show the highest absorption of compound was 2 hours. In case of media, the concentration of curcumin decreased as the incubation time was extended. HPLC analysis for identifying the accumulation of curcumin in cells showed that the accumulation within the cells was achieved by continuous treatment in 5 μM and 10 μM. As a result, the 3T3-Ll cell-based experiments show that intakes of polyphenol compounds, especially curcumin, quercetin and resveratrol, can prevent the differentiation of fat cells even at a low concentration. Also, according to the test of the bioavailability by HPLC analysis, the bioavailability of curcumin is very poor. curcumin quickly disintegrated within the cell after 2 hours. But as a result of curcumin treatment continuously in cells, the accumulation of curcumin in cells could be identified. As a result, if people continue to consume curcumin repeatedly, it will accumulate within the fat cells and have the inhibitory effect of differentiation and can prevent obesity.