Characterization of newly-isolated bacteriophages and improvement of phage stability for direct application on fresh foods

Abstract

식품의 식중독 균을 제어하기 위해 박테리오파지의 적용은 떠오르는 연구분야이다. 본연구에서는 대장균, 바실러스, 살모넬라, 황색포도상구균을 감염시키는 박테리오파지를 자연 시료 로부터 분리하였다. 분리된 신규 파지의 특성 분석을 진행하여 광범위한 숙주 특이성, 강력한 용해 활성 그리고 용균성 생활사를 갖는 파지를 식품 적용을 위해 선별하였다. 파지 칵테일이 채소에 자연적으로 오염되어 있는 대장균을 제거에 효과적임을 확인하였다. 식품에 오염된 식중독 균을 제어하는 목적으로 파지를 사용하기 위해서는 실험실 수준의 배지 형태가 아닌 식품에 적용 가능한 파지 형태에 대한 연구가 필요하다. 일반적으로 파지는 배지나 완충액에 안정적으로 보관되지만, 이형태로는 식품에 직접 적용할 수 없다. 본 연구에서는 파지가 식품 응용에 적합한 형태로 상온에서 용해 활성을 장기간 유지하기 위한 안정제가 개발되었다. 증류수에 분산되어 저장된 파지의 안정성은 상당히 낮다. 그러나 당이나 이온을 첨가하면 상온에서 보관된 파지의 생존율을 향상시킬 수 있다. 이때 사용되는 안정제의 종류에 따라 효과의 차이가 발생한다. 당과 이온을 동시 사용시 효과는 증대되었고, 상온에 보관된 파지의 활성은 6개월까지 안정적으로 유지되었다. 안정제가 첨가되어 장기간 상온에서 보관된 파지는 동일한 농도의 배지 형태의 파지와 동일한 항균 활성을 보였다. 대장균 O157:H7에 오염된채소에 안정제를 첨가한 파지 용액을 직접 떨어뜨렸을 때 대장균의 수가 현저히 감소했다. 또한, 대장균 O157:H7에 오염된 채소를 파지 수용액이 함유된 수돗물에 세척한 결과 수돗물로만 세척한 것에 비해 90% 이상의 항균 활성을 확인하였다. 앞선 안정제의 개발은 수용액 상태에서의 파지 안정성을 유지 할뿐만 아니라 파지가 코팅된 건조상태에서도 효과적이다. 안정제를 첨가하여 코팅된 파지는 건조 상태에서 7일 이상 활성을 유지하였다. 따라서 본 연구는 파지의 활성을 유지시킬 수 있는 효과적이고 경제적인 방법을 제공하고, 식품에 적용에 따른 상업화 가능성을 확인시켜준다. ;Application of bacteriophages to eliminate foodborne pathogens in food matrices is an emerging research field. In this study bacteriophages infecting Escherichia coli, Bacillus cereus, Salmonella, Staphylococcus aureus were isolated from environmental samples. Through biochemical and genomic characterizations, phages with broad host range, strong lysis activity and lytic life cycle were selected for food application. In this study also confirmed that treatment of phage cocktail reduced naturally contaminated E. coli on fresh food. For phage application to control foodborne pathogens, development of the phage composition should be accompanied from a laboratory level to food grade. Generally bacteriophages are stored in a stable manner in a medium or buffer, but in this state, bacteriophages cannot be directly applied to food. The objective of this study was to develop stabilizers to maintain lysis activity of phage for a long time at room temperature and phage-based products that are suitable for food application. The stability of the phage stored in distilled water was quite low. But the addition of sugar or ions significantly improved the survival rates of bacteriophages preserved at room temperature, although degree of efficacy was different depending on the type of stabilizer. When the two kinds of stabilizers were used in combination, the effect was increased and the bacteriophages stored at room temperature were stably maintained for 6 months. Bacteriophage stored for a long time mixed with stabilizers showed the same antibacterial activity as phage lysate at the same concentration. When a phage solution with stabilizer was directly dropped on fresh vegetables contaminated with E. coli O157:H7, the number of E. coli significantly decreased. In addition, when fresh vegetables contaminated with E. coli O157:H7 were washed in tap water containing a phage solution, more than 90% of antibacterial activity was confirmed compared to tap water washing. The develop of the stabilizer was not only effective on the phage stability in the solution state but also in phage coating (dry state). Phage coating with the addition of stabilizer maintained high titer for more than seven days. Addition of tap water to phage coated container for the use of washing E. coli contaminated fresh vegetables, more than 90% of E. coli were reduced than the container without phage coating. The results provide effective and economical method to maintain the activity of phage, and confirm the possibility of commercialization according to application to food.