Engineering of Enzymes and Whole Cell Biocatalysts for Value-Up of Long-Chain Fatty Acids

Abstract

Whole-cell biocatalysis is a prominent field which covers a wide range of product spectra, from C1 compounds to complex multi-carbon products. With consistent advancement in biocatalysis, including data science-driven enzyme discovery, in silico biosynthetic pathway design, and whole-cell biocatalyst engineering, novel biocatalysts can now be developed rapidly and efficiently. Here, various enzyme and whole-cell biocatalyst engineering strategies have been explored with an ultimate goal of the biosynthesis of industrially relevant fatty acid derivatives. The first case was engineering of the fatty acid double bond hydratases, which are involved in the detoxification of unsaturated fatty acids and the production of multi-functional hydroxy fatty acids. The fatty acid double bond hydratases of Lacticaseibacillus rhamnosus were cloned, purified, and subjected to kinetic and mutation studies. The fatty acid double bond hydratases from L. rhamnosus were unstable outside cells, but they could be stabilized by fusion with maltose-binding protein. Furthermore, the catalytic efficiencies for oleic and linoleic acid reached 0.102 and 0.066 s-1μM-1, respectively, under photo-driven FADH2-reduced condition. These values were comparable to those of the fatty acid double bond hydratase from Stenotrophomonas maltophilia, which is one of the most active enzymes. The second case was engineering of whole-cell biocatalysis. This study demonstrated that various C9 chemicals such as 9-aminononanoic acid, 1,9-nonanediol, 9-amino-1-nonanol, and 1,9-diaminononane could be produced from renewable C18 oleic acid. As a representative example, activation of 6 recombinant enzyme reactions (e.g., fatty acid double bond hydratase, long chain secondary alcohol dehydrogenase, Baeyer-Villiger monooxygenase, lipase, primary alcohol dehydrogenase, ω-aminotransferases) with repression of 1 native enzyme reaction (i.e., aldehyde dehydrogenase) in Escherichia coli-based biocatalysis led to formation of 9-aminononanoic acid to an isolation yield of 54% from oleic acid via 10-hydroxyoctadecanoic acid, 10-keto-octadecanoic acid, 9-(nonanoyloxy)nonanoic acid, 9-hydroxynonanoic acid, and 9-oxo-nonanoic acid. The final study has focused on a novel protein engineering platform that integrates ancestral sequence reconstruction (ASR) with AI-based protein stability prediction. Using sequence-based clustering and ASR tools, a thermostable ancestor (ANC) of the Baeyer-Villiger monooxygenase from Pseudomonas putida KT2440 (PpBVMO_ANC) was constructed. The PpBVMO_ANC led to approximately a 5-fold improvement in whole-cell biotransformation performance compared to the wild-type BVMO. This improvement might be due to both the high activity of PpBVMO_ANC and its stability. To identify the amino acids that directly impact structural stability throughout the evolution, various AI-based tools were employed for computation. Subsequently, mutational effects of the candidates on stability were validated by incorporating them into a PpBVMO variant, which had been constructed in our previous study (i.e., PpBVMO_C302L/M340L/M380L (PpBVMO_3M)). Notably, among the six candidates, H409Y mutant exhibited 1.5-fold greater thermostability and a 1.8-fold higher catalytic efficiency. Overall, this study addresses various enzyme and whole-cell biocatalysis engineering strategies, which may contribute to understanding and engineering of complex biotransformation systems for the biosynthesis of industrially relevant fatty acid derivatives.;전세포 생물전환은 C1 화합물부터 복잡한 다탄소 화합물에 이르기까지 넓은 생산물 스펙트럼을 다루는 중요한 분야이다. 전세포 생촉매 분야의 지속적인 발전은 빅데이터 기반 신규 효소 발견, 컴퓨터 시뮬레이션 기반 생합성 경로 설계, 그리고 신규 효소를 빠르고 효율적으로 개발하는 데에 기여하였다. 본 연구에서는 산업적으로 중요한 지방산 유도체의 생합성을 목표로 다양한 효소 및 전세포 생촉매 엔지니어링 전략을 탐구하였다. 첫 번째 사례는 불포화 지방산의 해독 및 다기능성 하이드록시 지방산의 생산에 관여하는 지방산 이중결합 수화효소의 엔지니어링 연구이다. Lacticaseibacillus rhamnosus로부터 유래한 지방산 이중결합 수화효소를 클로닝하고 정제하여 효소 반응속도 도출 및 돌연변이 연구를 수행하였다. 이 효소는 세포 외부 환경에서 안정성이 떨어지는 한계를 보였으나, 말토스 결합 단백질과의 융합을 통해 구조적으로 안정화를 할 수 있었다. 또한, 빛에 의해 활성화된FADH₂환원 조건에서 올레산과 리놀레산에 대한 촉매 효율이 각각 0.102 s⁻¹μM⁻¹과 0.066 s⁻¹μM⁻¹에 도달했으며, 이는 가장 활성이 높은 효소 중 하나인 Stenotrophomonas maltophilia의 효소와 유사한 수준이었다. 두 번째 사례는 전세포 생물전환의 엔지니어링에 관한 연구이다. 본 연구는 재생 가능한 C18 올레산으로부터 9-aminononanoic acid, 1,9-nonanediol, 9-amino-1-nonanol, 1,9-diaminononane와 같은 다양한 C9 화학물질을 생산할 수 있음을 입증했다. 대표적인 예로, Escherichia coli 기반의 생촉매에 6개의 재조합 효소 반응(fatty acid double bond hydratase, long chain secondary alcohol dehydrogenase, Baeyer-Villiger monooxygenase, lipase, primary alcohol dehydrogenase, ω-aminotransferase)을 활성화하고 1개의 내재 효소 반응(aldehyde dehydrogenase)을 억제함으로써 올레산으로부터 9-aminononanoic acid를 54% 분리 수율로 생산하였다. 이 과정은 10-hydroxyoctadecanoic acid, 10-keto-octadecanoic acid, 9-(nonanoyloxy)nonanoic acid, 9-hydroxynonanoic acid, 그리고 9-oxo-nonanoic acid를 거쳐 진행되었다. 마지막 사례는 조상 서열 재구성(ASR)과 AI 기반 단백질 안정성 예측을 융합한 새로운 단백질 공학 플랫폼 개발에 대한 연구이다. 이를 통해 Pseudomonas putida KT2440에서 유래한 Baeyer-Villiger monooxygenase(PpBVMO)의 열안정성이 확보된 조상 (thermostable ancestor, PpBVMO_ANC)을 설계하였다. PpBVMO_ANC은 wild-type BVMO 대비 약 5배 향상된 전세포 생물전환 성능을 보여주었으며, 이는 높은 효소 활성과 안정성에 기인할 가능성이 있다. 진화 과정에서 구조 안정성에 영향을 미치는 아미노산을 식별하기 위해 다양한 AI 기반 도구를 사용하였으며, 후보로 선정된 아미노산의 안정성에 대한 돌연변이 효과는 이전 연구에서 제작한 PpBVMO 변이체(PpBVMO_C302L/M340L/M380L)에 도입하여 검증하였다. 특히, H409Y 돌연변이는 1.5배 더 높은 열안정성과 1.8배 더 높은 촉매 효율을 나타냈다. 종합적으로, 본 연구는 다양한 효소 및 전세포 생물전환 엔지니어링 전략을 다룸으로써 복잡한 생물전환 시스템에 대한 이해를 증진시키고, 산업적으로 중요한 지방산 유도체의 생합성을 위한 공학적 접근법 개발에 기여할 것으로 사료된다.