Anti-obesity effects of neohesperidin dihydrochalcone and NHDC-O-glycoside in vitro and in vivo

Abstract

Neohesperidin dihydrochalcone (NHDC) is a semi-natural and low-caloric substance from bitter orange and it is used for an alternative sweetener. NHDC-O-glycoside (GNHDC) is processed by adding a glycosyl group to NHDC. NHDC and GNHDC are the alternative sweeteners which can be sugar substitutes. This study was designed to determine the anti-obesity effects of NHDC and GNHDC both in vitro and in vivo. For in vitro experiment, 50 μM NHDC or GNHDC was treated in murine preadipocytes, 3T3-L1 cells, during differentiation into adipocytes. Both sweeteners suppressed lipid accumulation, and down-regulated mRNA expression of lipogenesis and adipogenesis markers, such as sterol regulatory element-binding protein 1 (Srebp1c), fatty acid synthase (Fas), peroxisome proliferator-activated receptor gamma (Pparγ), and CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/ebpα). In addition, they inhibited mRNA expression of proinflammatory cytokines, including tumor necrosis factor alpha (Tnfα), interleukin 1 beta (Il-1β), and monocyte chemoattractant protein 1 (Mcp1). Furthermore, NHDC and GNHDC treatment also inhibited protein expression of phosphoinositide 3 kinase (PI3K)/protein kinase B (AKT)/mammalian target of rapamycin (mTOR) and activated AMP-activated protein kinase (AMPK). For in vivo experiment, male C57BLKS/J db/db mice were randomly assigned into control, NHDC and GNHDC. Three groups are vehicle control, NHDC (100 mg/kg body weight), and GNHDC (100 mg/kg body weight). They are fed each material by an oral gavage for 4 weeks. NHDC and GNHDC supplementation reduced body weight gain, subcutaneous, and total adipose tissues weight compared to the control group. They suppressed size of adipocytes analyzed by hematoxylin and eosin (H&E) staining. They also down-regulated mRNA expression of fatty acid uptake markers, including cluster of differentiation 36 (Cd36) and lipoprotein lipase (Lpl), and lipogenesis and adipogenesis markers, including Srebp1c, Fas, Pparγ, and C/ebpα. Moreover, both sweeteners up-regulated mRNA expression of β-oxidation markers, including acyl-CoA synthetase long-chain family member 1 (Acsl1), acyl-CoA oxidase 1 (Acox1), and carnitine palmitoyltransferase 1 alpha (Cpt1α), and fat browning markers, including uncoupling protein 1 (Ucp1), peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 alpha (Pgc1α), and positive regulatory domain 16 (Prdm16). Interestingly, GNHDC exerted more significant anti-obesity effects than NHDC. In conclusion, these results demonstrated that NHDC and GNHDC could be effective fat reducing sweeteners by regulating lipid metabolism.;네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 (NHDC)은 오렌지의 쓴맛 성분으로부터 유래한 반천연감미료이자 낮은 칼로리를 내는 물질로서, 대체감미료로 사용되곤 한다. 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 당전이체 (GNHDC)는 NHDC와 당의 글리코시드 결합을 통해 생성된다. 이러한 NHDC와 GNHDC는 설탕을 대신하는 대체감미료로 이용될 수 있다. 본 연구는 NHDC와 GNHDC의 항 비만 효과를 in vitro와 in vivo 수준에서 확인하기 위하여 설계되었다. 먼저 in vitro 실험에서 전지방세포인 3T3-L1 세포의 분화 기간 동안 50 μM NHDC 또는 GNHDC를 처리하였다. 두 감미물질을 처리함에 따라 대조군 대비 세포 내 지방 축적이 감소하였으며, 지방세포의 분화 또는 합성을 촉진하는 Srebp1c, Fas, Pparγ, C/ebpα의 mRNA 발현 역시 감소하였다. 또한 염증성 사이토카인으로 알려진 Tnfα, Il-1β, Mcp1의 발현도 감소하였다. PI3K/AKT/mTOR 신호전달 경로의 단백질 활성 역시 감소하였으며, 반대로 이와 관련되어 있는 AMPK의 단백질 활성은 증가하였다. 이후 in vivo 실험을 통해 C57BLKS/J db/db 마우스에 두 감미물질을 경구투여 하였다. 인산 완충 생리식염수를 제공하는 대조군, 킬로그램 체중 당 100 mg의 감미물질을 제공하는 NHDC 군과 GNHDC 군의 세 개의 그룹으로 나누어 총 4주 동안의 실험을 진행하였다. NHDC와 GNHDC 공급에 따라 체중 증가량, 피하지방 무게 및 총 지방 무게가 대조군 대비 감소하였다. 헤마톡실린&에오신 (H&E) 염색을 통해 두 감미물질이 지방조직 내 세포 크기를 조절함을 확인하였다. 또한 두 물질은 세포 내 지방산 유입 및 지방 대사와 관련되어 있는 Cd36, Lpl, Srebp1c, Fas, Pparγ, C/ebpα의 mRNA 발현을 감소시켰다. 더 나아가 베타-산화와 관련되어 있는 Acsl1, Acox1, Cpt1α와 갈색 지방화와 관련되어 있는 Ucp1, Pgc1α, Prdm16의 mRNA 발현을 증가시켰다. 특히 GNHDC 군에서의 항 비만 효과가 NHDC 군 대비 유의적으로 나타남을 확인하였다. 결론적으로, 본 연구의 결과는 NHDC와 GNHDC가 지방 대사 조절을 통한 지방 감소 효과를 갖는 대체감미료임을 시사하였다.