Relationships of NAD metabolism, ER stress, and Circadian Clock Regulation in the Liver

Abstract

산화환원반응의 보조인자로 작용하는 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 (Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)는 신진대사에서 다양한 기능을 조절한다. 특히 노화가 진행되면 NAD+가 감소되기 때문에, 노화 모델에서NAD 전구물질을 보충하면 항 노화 효과를 나타낸다는 것이 다수의 연구를 통해 증명된 바 있다. 최근 젊은 층에서는 운동부족과 서구식 식생활 등으로 인해 NAD 감소를 유발하는 대사 장애가 지속적으로 증가하고 있다. 그러나, 젊은 세대에서 대사적 스트레스 상황이 있을 때 NAD 전구물질이 효과를 나타낼 수 있는지에 대한 연구는 부족한 상태이다. 따라서, 본 연구에서는 일반식과 고지방식을 6주간 급이한 5주령의 젊은 나이의 생쥐모델에 NAD 전구물질 중 하나인 니코틴아마이드 모노뉴클레오타이드(Nicotinamide mononucleotide, NMN, 500mg/kg)를 1달간 투여하고 간대사에 미치는 영향을 조사하였다. 동물실험 결과, NMN투여는 급이한 식사와 상관없이 체중과 지방량을 유의하게 감소시켰다. 장기간 NMN 보충 전사체 공개 데이터의 이차 분석을 통해, NMN을 장기간 보충 시 간에서의 비접힘 단백질 반응 감소 및 소포체 스트레스 관련 유전자의 활성 감소를 보여,NMN 투여의 표적 경로로 소포체 스트레스 경로를 도출하였고, 전사인자 모티프 분석을 통해 생체시계 유전자로 조절되는 유전자들이 표적으로 활성화됨을 보였다. NMN투여한 젊은 나이의 생쥐모델에서 도출된 경로를 확인한 결과, 첫째, 고지방식이에 의해 발생된 소포체 스트레스 유도를 완화하는 효과를 보였고, 이는 세포실험을 통해 다시 증명되었다. NAD 회수경로에서의 제 1 속도제한효소인 니코틴아마이드 포스포리보실트랜스퍼라제(Nicotinamide phosphoribosyl-transferase, NAMPT)의 발현을 억제하였을 때 소포체 스트레스 관련 유전자의 발현 패턴에서 변화가 발생하는 것을 확인하였으며, 세포에서siRNA를 통해 NAMPT유전자의 발현을 억제했을 경우, 소포체 스트레스에 관여하는 유전자 발현이 증가하였다. 둘째, 공개 데이터의 이차 분석을 통해 장기간 NMN 보충을 한 생쥐에서 일주기리듬에 관여하는 주 전사인자의 활성화가 관찰되었지만, 단기간 NMN 투여한 경우에 일주기리듬 관여 유전자의 발현은 큰 변화가 없었다. 그러나, 간에서 NAMPT를 억제한 경우 간에서의 일주기리듬의 위상 이동이 관찰되었고, 이는 고지방식이를 한 생쥐의 경우에도 유사한 패턴을 보였다. 따라서, 본 연구는 NMN 단기간 투여 시의 고지방식이 유도 소포체 스트레스 완화 효과를 보였다. 또한, 유전자 변형 및 식이로 인한 대사적 스트레스가 간에서의 일주기 리듬 위상 변화를 보여, 간에서의 일주기 리듬 위상 변화와 대사적인 상태와의 연관성을 제안한다. 본 연구는 기존에 알려진 항노화를 위한 NMN 활용 뿐 아니라 향후 젊은 세대에서의 만성질환 예방에 활용할 수 있는 가능성을 보인 기초자료를 제공하였다는 의의가 있다.;Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) is an endogenous substance acting as a co-factor in redox reactions and regulates various functions in metabolism. Recent research has focused on studying its involvement in the pathway of anti-aging, which is robustly induced by calorie restriction (CR). For example, nicotinamide riboside (NR) supplementation improved aging-related cardiovascular biomarkers in healthy middle-aged adults and decreased blood inflammatory cytokines. Moreover, nicotinamide mononucleotide (NMN) supplementation exhibited improvement of insulin sensitivity as well as increasing NAD+ levels. Despite these effects, little is known about its effects on young adults. Since low NAD+ levels are detected not only by aging, but also metabolic disorders such as obesity, diabetes, and hepatic steatosis, investigation on effects of NAD precursors on metabolic regulation in young adults would provide new insights. Effects of boosting NAD+ have been explored in mostly aged or aging-related metabolic stress mouse models especially in the liver. Moreover, liver-specific overexpression of nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) weakened alcohol-induced fatty liver disease and NR administration recovered liver injury of liver-specific Nampt knockout (KO) mice. These results suggested that boosting NAD+ might improve metabolic regulation in the liver even in the young mouse model. Therefore, this study was aimed to investigate how short-term NMN intervention affected normal or mild obese state especially on hepatic mechanism. The 500 mg/kg of NMN was intraperitoneally administrated for a short period of time to the young mice that were fed control diet (CD) or high fat diet (HFD). As a result, short-term NMN administration showed a significant decrease in body weight and fat mass and alteration in food and water intakes, while did not show significant improvement of glucose tolerance in both diet groups. In terms of NAD+ metabolism, the NMN administration changed expression of several genes in the NAD+ salvage pathway, indicating that NMN administration altered the NAD pathway as expected. For example, gene expression of Nmnat1 was increased and Nmnat2 was decreased by short-term NMN administration. And NMN reduced HFD-induced Nnmt expression, and NMN also decreased expression of Nampt regardless of the type of diet. Secondary analysis using publicly available transcriptomic data was performed to screen potential targets of NMN administration in the liver. The analysis on the data from a long-term NMN supplementation revealed a decrease in unfolded protein response (UPR) pathway in the liver and an increased transcriptional activity of core circadian components by NMN administration. We further analyzed expression of the genes related with endoplasmic reticulum (ER) stress pathway and circadian rhythm in NMN-treated young mice. Short-term NMN administration alleviated HFD-induced hepatic ER stress in the liver. The effect on ER stress was confirmed by in vitro experiment showing that NMN treated AML12 cells, mouse hepatocytes, exhibited low mRNA expression of ER stress-related genes. Moreover, short interfering RNA (siRNA)-mediated suppression of Nampt gene induced expression of ER stress-related genes, especially including Hspa5 and Ddit3, in vitro. In in vivo data from genetically modified mouse model with liver-specific NAMPT deletion, liver-specific Nampt KO mice exhibited disrupted expression of ER stress-related genes, especially with alteration of their oscillating patterns. Since hepatic transcriptomic analysis of NMN intervention showed enrichment of circadian core clock components including aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like protein 1 (ARNTL) and clock circadian regulator (CLOCK), we investigated hepatic circadian clock oscillation within metabolic disorders that induce ER stress dysregulation. Interestingly, liver-specific Nampt KO mice and HFD-fed mice both exhibited advanced phase-shifts in hepatic circadian clock, which was reversed by time-restricted feeding (TRF). However, short-term NMN administration exhibited notable changes neither in the amplitude of oscillation, nor overall expression levels of the clock genes. Therefore, our results demonstrated that NMN-mediated enhancement of the NAD pathway alleviated hepatic ER stress through in vivo and in vitro experiments, and the ER stress led to phase-shifts on circadian core clock oscillation in the genetic as well as diet-induced models. Our findings provide the evidence that NMN administration modified hepatic molecular pathways, in particular ER stress and circadian pathways, suggesting a potential application of NMN for the chronic disease prevention in young adults.