Sex differences in inflammation in azoxymethane/dextran sodium sulfate-induced colitis-associated colorectal cancer mice

Abstract

대장암(CRC)은 2020년에 전 세계적으로 세 번째로 많이 진단된 암이자 두 번째로 높은 사망률을 나타내는 암이다. 암은 매우 복잡하고 이질적인 질병이기 때문에 개인화된 표적 항암 치료의 중요성이 높아지고 있다. 대장암 발병률은 여성에서 더 낮으며 더 늦은 시기에서의 발병을 보인다. 에스트로겐과 에스트로겐 수용체는 모두 위장관 질환에 다양한 영향을 미친다고 기존 연구를 통해 알려져 있다. 본 연구의 목적은 대장염 관련 대장암에서의 성적 이형성이 에스트로겐과 에스트로겐 수용체에 의해 영향을 받는지 조사하는 것이며, 대장암의 진행단계에 따라 에스트로겐과 에스트로겐 수용체의 역할이 달라지는지 연구하는 것이다. 대장염 관련 초기 대장암 모델로는 AOM/DSS 마우스 모델을 사용했다. 생후 5주의 수컷과 암컷 Balb/c 쥐를 반입한 후 일주일 간의 적응 기간을 가진 후 암수컷 각각 정상 대조군과 AOM/DSS 투여그룹으로 10마리씩 무작위로 배정하였다. 동물실험 기간 중엔 이틀에 한번씩 질병반응성지수(DAI)가 측정되었고 희생 직후 대장 전체와 그 외 조직들을 수집해 보관하였다. 염증성 사이토카인의 발현 수준에 대한 성별의 영향을 알아보기 위해 TNF-α, IFN-γ, IL-4의 발현을 분석하였고 염증과 종양 발생과정에서 ER-α와 ER-β의 기능을 조사하기 위해 웨스턴 블랏과 PCR 분석을 수행하였다. 질병반응성지수(DAI) 점수는 수컷 AOM/DSS 투여(M-AOM/DSS) 그룹과 암컷 AOM/DSS 투여(F-AOM/DSS) 그룹 간 여러 날에서 유의한 차이를 보였으며, 모든 DAI 점수는 M-AOM/DSS 그룹에서 더 높았다. 대장 길이에서는 암컷 그룹만이 유의미한 감소를 보였기 때문에, 대장 내 염증 상태는 F-AOM/DSS 그룹에서 더 심각한 것으로 나타났다. 내장지방 부피의 합은 성별과 AOM/DSS 투여 여부 간에 상호작용을 보였다. 수컷의 경우 정상 대조군에 비해 AOM/DSS 그룹에서 내장지방 부피가 감소한 반면 암컷은 AOM/DSS 그룹에서 증가하는 경향을 보여, F-AOM/DSS 그룹이 M-AOM/DSS 그룹보다 유의하게 높은 내장지방량을 보였다. ER-α와 ER-β의 mRNA 및 단백질 발현은 정상 대조군과 비교하여 AOM/DSS 그룹에서 매우 유의하게 상향 조절되었으며, 정상 대조군과 AOM/DSS 그룹을 비교했을 때 암컷 그룹은 수컷 그룹보다 높은 증가율을 보였다. 에스트로겐과 ER-β의 종양 억제 효과를 조사하기 위해 암줄기세포 마커를 분석한 결과, β-catenin의 단백질 발현의 정상 대조군과 AOM/DSS 그룹 간의 비교에서 수컷 그룹만이 통계적으로 유의미한 증가를 보였다. 염증의 경우, T helper 세포 관련 사이토카인인 TNF-α, IFN-γ, IL-4 가 F-AOM/DSS 그룹에서 M-AOM/DSS 그룹보다 유의하게 상향 조절되었다. 결과를 종합하면, 에스트로겐과 상향 조절된 에스트로겐 수용체는 염증을 촉진하는 효과를 나타내지만, 초기 대장암 모델에서 종양 발생은 보호하는 효과를 보였다.;Colorectal cancer (CRC) represents the third most diagnosed cancer and the second highest cancer for mortality among men and women globally in 2020. Since cancer is a highly complex and heterogeneous disease, personalized and targeted anticancer treatment has become important. CRC incidence shows a lower rate and postponed onset in women than in men. Both estrogen and estrogen receptors (ERs) show several effects on gastrointestinal tract diseases. The aim of this study is to examine whether sexual dimorphism in colitis-associated CRC is mediated by estrogen and estrogen receptor and this sexual dimorphism may be caused by the different hormones and receptor depend on the stage of CRC. To simulate colitis-associated cancer, azoxymethane (AOM)/dextran sodium sulfate (DSS) mouse model was used. Six-week-old male and female Balb/c mice were randomly divided into normal control (NC) and AOM/DSS group (n=10/group) respectively. During the experiment, disease activity score (DAI) was measured. Right after the sacrifice, whole colon and other tissues were dissected. To examine the effects of sex on inflammatory cytokine, mRNA expression of tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interferon gamma (IFN-γ), and interleukin 4 (IL-4) were analyzed. To determine the functional role of ER-α and ER-β in inflammation and tumorigenesis, western blot and real time PCR analysis were performed. Disease activity index (DAI) score of several days showed significant differences between male AOM/DSS-treated (M-AOM/DSS) group and female AOM/DSS-treated (F-AOM/DSS) group, and all DAI scores were higher in M-AOM/DSS group. In colon length, only female group showed significant decrease, which indicates severe site-specific inflammation in colon. Sum of visceral fat weight showed significant sex-AOM/DSS treatment interaction and F-AOM/DSS group showed significantly higher fat weight than M-AOM/DSS group. The mRNA and protein expressions of both ER-α and ER-β were upregulated very significantly in AOM/DSS groups compared to NC groups and female groups showed higher increase ranges than male groups. To investigate the effect of estrogen and ER-β on cancer stemness, expression of β-catenin was analyzed. The expression of β-catenin was significantly increased only in AOM/DSS male groups. In terms of inflammation, T helper (Th) cell-related cytokines, expression of TNF-α, IFN-γ, and IL-4 were significantly up-regulated in F-AOM/DSS group than M-AOM/DSS group. Taken together, the results suggest that different levels of endogenous estrogen in male and female and up-regulated ERs in both sexes exhibit pro-inflammatory effects, whereas up-regulated ERs protects against tumorigenesis in early CRC model. The effects were more notable in female. These results are due to the complicated mechanism of endogenous estrogen and ERs, which shows both pro-inflammatory and cancer-inhibiting roles depending on different sexes and disease stages.