Screening of Olfactory Receptor 6M1 Ligands by Surface Plasmon Resonance

Abstract

Smell is one of the five basic senses and a closely related sense with food quality. Smell perception in mammals is initiated by binding odorant molecules to olfactory receptors (ORs) on the olfactory sensory neurons. Human have approximately 400 different types of ORs, but individual characteristics and function of ORs are rarely known. To study OR function, the priority is to investigate ligands of each OR. In this study, we present highthroughput screening approach for identification of OR6M1 ligands using OR6M1-stably expressed cell line, fragments of cell membrane, and OR-based surface plasmon resonance (SPR) system. OR6M1-stably expressed cell line was developed using OR6M1 and RTP1 in HEK293T cells. To discover the ligands of OR6M1, a total of 109 chemicals were screened using whole cell-based SPR system. As a result, two chemicals (anthraquinone and rutin trihyrate) showed putative OR6M1 ligands due to activation of whole cell expressing OR6M1 and dose-dependent responses to two ligands. To improve the sensitivity, the fragmentation of cell membrane containing OR6M1 was extracted and immobilized onto the SPR chip and the responses to anthraquinone were compared between whole cell-based and cell membrane fragment-based system. As a result, the OR6M1 sensitivity to ligands was greater in the cell membrane fragment-based than in that the whole cell-based SPR system and the fragments of cell membrane maintained OR6M1 structures stably. Finally, two putative OR6M1 ligands were distinguished between agonist and antagonist using calcium imaging on OR6M1-expressing Hana3A cells. In conclusion, anthraquinone was a putative OR6M1 agonist, whereas rutin trihydrate was a putative OR6M1 antagonist. Because ORs are expressed not only in olfactory tissue, but also in non-olfactory tissues, this finding could be applied to various tissues which expressed OR6M1. Therefore, it can be applied to the study of biological functions of anthraquinone and rutin trihydrate to the expression of OR6M1 in nonolfactory tissues. In addition, the development of olfactory receptor cell-based sensor system, SPR, can suggest that management of food quality, detection of toxic substance and diagnose to diseases.;인간은 미각, 후각, 청각, 시각, 촉각으로 다섯 가지의 감각을 가지고 있다. 이 다섯 가지의 감각을 오감이라고 부른다. 이 오감에 대한 연구는 많이 진행되고 있으나 오감 중 후각에 대한 연구는 복잡한 매커니즘에 의해 후각에 관련된 연구는미비한 실정이다. 최근에는 후각 수용체가 후각 조직에서만 발현되는 것이 아니라 비 후각 조직에서도 발현된다고 연구가 진행되었다. 본 연구에서는 후각 수용체를 선정하여 후각 수용체 발현 세포주 OR6M1 (Olfactory receptor 6M1)을 구축하고 표면 플라즈몬 공명 현상 (SPR, Surface Plasmon Resonance)을 이용하여 후각 수용체 기반 센서시스템을 개발하였다. 후각 수용체 조절 소재 발굴을 위해 109 종의 소재로 스크리닝을 진행하여 후각 수용체 OR6M1 발현 세포와 반응성이 있는 소재 1 종인 Anthraquinone을 선정하여 농도별로 OR6M1 발현 세포와의 반응성을 확인하였다. 또한, 세포에서의 반응성을 확인한 뒤, 세포 막 단백질에서의 반응성 감도 증가를 확인하기 위해 OR6M1 발현 세포의 막 단백질을 추출하여 109종의 소재를 스크리닝 하였다. 그 결과, 막 단백질에서 anthraquinone과 rutin trihydrate의 반응성을 확인하였다. OR6M1 발현 세포에서의 반응성보다 세포 막 단백질에서의 반응성의 감도가 더 좋은 것으로 나타났다. 두 가지 소재 anthraquinone과 rutin tirhydrate에 대해 agonist와 antagonist를 확인하기하기 위해 Hana3A 세포에 OR6M1을 발현시켜 calcium level을 측정하였다. 그 결과, anthraquinone은 세포 내 칼슘을 증가시키고, rutin trihydrate는 세포 내 칼슘 증가를 억제하는 것으로 추정된다. 후각 수용체는 후각조직뿐만 아니라 비 후각조직에서의 발현이 확인되었다. 향후 연구에서 비 후각조직에서의 OR6M1 발현을 통해 생물학적 기능 연구에 적용시킬 수 있을 것으로 예상한다. 게다가, 후각 수용체 세포주 기반 센서의 개발의 개발로 식품 품질관리, 유해물질 감지, 질병 진단 등에 적용시킬 수 있을 것으로 예상한다.