Discovery and Characterization of a Novel 9S-lipoxygenase from Enhygromyxa salina for fatty acid biotransformations

Abstract

리폭시제네이스(LOX)는 옥시리핀을 위치/입체 특이적으로 합성하는데 관여하는 핵심적인 효소이다. 옥시리핀은 구조적으로 다양하고 생물학적으로 활성화된 산소화 자연 생성물의 그룹이며, 인간의 염증 반응에 관여하는 필수적인 신호 전달자 이다. 그러나 리폭세제네이즈는 다양한 식물과 동물에 존재하지만, 미생물에서는 흔히 보고되지 않았다. 더욱이, C18-다불포화 지방산을 9S-하이드로 퍼옥시 지방산으로 산화시키는 9-LOX는 미생물원에서 거의 발견되지 않았다. 따라서 우리는 엔하이그로미사 살리나(Enygromyxa salina) 유래의 9S-리폭시게네이즈 (EsLOX)를 발견했다. 해당 효소는 대장균에서 활성적인 형태로 발현되었으며, 다양한 다불포화 지방산의 9번 탄소 위치의 (S)-입체 이산소화반응에 대해 높은 활성을 보였다. 리놀레산, α-리놀렌산, β-리놀렌산 및 아라키돈산에 대한 촉매 효율은 각각 3.94, 1.42, 1.38 및 0.69 μM-1 s -1이었다. 삼차 구조 분석을 통해 확인한 효소의 구조적 특징은 리놀레산 및 아라키돈산에 대해 특이적으로 높은 효소 의 위치특이성을 입증했다. 전 세포 생체 촉매로서 최적화하기 위해, 수용성 발현 향상을 위한 MBP-EsLOX 퓨전 효소를 구축하였고, 상기 효소를 대장균에 발현시켜 전세포 생촉매로 이용할 경우 리놀레산 등의 불포화 지방산으로부터 고농도의 9-히드록시 지방산 (예로 9- 히드록시옥타데카다이에노익산, 9-히드록시옥타데카트리에노익산)을 빠른 속도로 생산할 수 있음을 확인하였다. 예를 들어, 100 mM 리놀레산은 재조합된 Escherichia coli BL21(DE3) pb4-EsLOX를 사용하여 83mM의 9-히드로퍼옥시옥타데 카다이에노익산으로 전환되었다. 또한, 엔히그로미사 살리나 유래 리폭시게나아제 및 클로렐라 베리어빌리스 유래 탈탄산 효소을 공동발현하는 재조합 균주를 구축하고, 이를 전세포 생촉매로 이용하여 리놀레산 등의 불포화 지방산으로부터 이차 지방 알콜을 생산할 수 있음을 확인하였다. 본 연구는 하이드록시 지방산과 2차 지방 알코올뿐만 아니라 생체고분자 단량체(예: 1,9-노나네이드산 및 9-아미노노나노산)와 녹색 잎 휘발성체(예: (3Z)-노넨알, (2E)-노넨알 (3Z,6Z)- 노나디에날 (2E, 6Z)-노나디에날의 생합성에 기여할 것으로 기대되어진다.;Lipoxygenase (LOX) is an important enzyme involved in the regio- and stereoselective synthesis of oxylipins. The oxylipins, oxygenated natural molecules derived from fatty acids, are structurally diverse, biologically active and are essential signaling agents responsible for human inflammatory responses. However, the enzymes are present in a various plants and animals, but have been reported in few microorganisms. Moreover, 9S-LOXs, which oxidize C18-polyunsaturated fatty acids to 9S-hydroperoxy fatty acids, were rarely found in microbial sources. Here, we discovered a novel 9S-LOX from Enhygromyxa salina (EsLOX). The enzyme was expressed functionally in Escherichia coli and showed high activity for dioxygenation of polyunsaturated fatty acids with (S)-configuration at the C9 position. The catalytic efficiency for linoleic acid, α-linolenic acid, γ-linolenic acid, and arachidonic acid was 3.94, 1.42 1.38, and 0.69 μM−1∙s−1, respectively. Spatial features of X-ray structure of the enzyme support well its high regiospecificity to exclusively 9(S)-configuration with linoleic acid, α-linolenic acid, γ-linolenic acid, and arachidonic acid. To optimize as a whole cell biocatalyst, EsLOX was fused with maltose binding protein (MBP), which led to the synthesis of target products with high-conversion. For instance, 100 mM linoleic acid was transformed into 83 mM 9S-hydroxy-(10E,12Z)-octadecadienoic acid by using the recombinant Escherichia coli BL21(DE3) pb4-EsLOX and Chemical reducing agent. In addition, the enzyme was successfully used for the cascade reactions to generate a secondary fatty alcohol [i.e., 8S-hydroxy-(9E,11Z)-heptadecadiene] from the hydroxy fatty acid [i.e., 9S-hydroxy-(10E,12Z)-octadecadienoic acid] by coexpressing EsLOX and photoactivated decarboxylase from Chlorella variabilis NC64A, with a conversion of ca. 70 % in a one-pot biocatalyst. This study will contribute to the biosynthesis of not only hydroxy fatty acids and secondary fatty alcohols but also biopolymer monomers (e.g., 1,9- nonanedioic acid and 9-aminononanoic acid) and green leaf volatiles (e.g., (3Z)-and (2E)-nonenal, (3Z,6Z)-and (2E,6Z)-nonadienal).