Exploring Microbial Stress Metabolism and Enzyme Stability for the Productive Whole Cell Biocatalysis

Abstract

Whole-cell biocatalysis is a powerful technology, which allows efficient production of biomolecules and fine chemicals. However, whole-cell biocatalysts are often exposed to various stresses limiting their activities and performances. Thereby, this study has focused on understanding stress metabolisms of one of the representative yeasts and bacteria (i.e., Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli) as well as stability of enzymes (i.e., Baeyer-Villiger monooxygenases) under process conditions. First, cellular responses of S. cerevisiae to high temperatures of up to 42°C during ethanol fermentation were investigated. Increased temperature led to stimulation of glucose uptake to produce not only the thermal protectant glycerol but also the fermentation products (e.g., ethanol and acetic acid). Moreover tricarboxylic acid (TCA) cycle was activated with high cultivation temperature. These changes could be caused by the increased cellular maintenance energy. Notably, acetic acid production was substantially stimulated compared to that of other metabolites. The acetic acid produced in addition to ethanol seemed to subsequently result in adverse effects, leading to increased production of reactive oxygen species. This, in turn, appeared to cause the specific growth rate and glucose uptake rate reduced leading to decrease of the specific ethanol production rate far before glucose depletion. These results suggest that adverse effects from heat, acetic acid, ethanol, and oxidative stressors are synergistic, resulting in decrease of the specific growth rate and ethanol production rate and, hence, are major determinants of cell stability and ethanol fermentation performance of S. cerevisiae at high temperatures. Next, the cellular responses of E. coli toward medium chain fatty acid (i.e., n-heptanoic acid)-induced stress were investigated. The metabolic and genomic responses of E. coli strains under n-heptanoic acid stress indicated that GadA/B-based glutamic acid-dependent acid resistance (GDAR) system might be critical for cellular tolerance. Thereby, the rcsB and dsrA genes, of which the gene products are involved in the activation of GadE and RpoS, respectively, were introduced in E. coli BL21(DE3). Activation of the GDAR system was able to lead to increase of tolerance to HCl as well as to n-heptanoic acid. Furthermore, activation of the GDAR system allowed the recombinant E. coli BL21(DE3) expressing the alcohol dehydrogenase (ADH) of Micrococcus luteus and Baeyer-Villiger monooxygenase (BVMO) of Pseudomonas putida to reach 60% greater product concentration in the biotransformation of ricinoleic acid (i.e., 12-hydroxyoctadec-9-enoic acid) into n-heptanoic acid and 11-hydroxyundec-9-enoic acid. With an aim to further improve biocatalytic efficiency of the recombinant E. coli BL21(DE3) expressing the ADH of M. luteus and the BVMO of P. putida, BVMO engineering was investigated. After thorough investigation of the enzyme properties, Cys302 was suggested as an engineering target, because Cys302 was close to the flavin-peroxide, which may generate the reactive oxygen species. The substitution of Cys302 to Leu led the engineered enzyme more stable in the presence of hydrogen peroxide and under high temperature. Furthermore, the engineered enzyme (i.e., E6BVMOoptC302L) allowed the recombinant E. coli BL21(DE3) pATPm-E6BVMOoptC302L-ADH expressing the engineered enzyme and the ADH of M. luteus to show greater biotransformation activity. As a result, the recombinant E. coli pATPm-E6BVMOoptC302L-ADH was able to retain the catalytic activity even at the second round of ricinoleic acid biotransformation after the first round of biotransformation and product recovery. This study may contribute to engineering of S. cerevisiae- and E. coli-based biocatalysts for the production of high value-added products such as ethanol and carboxylic acids.;미생물과 효소를 기반으로 한 생촉매반응은 다양한 고부가가치 소재의 개발에 중요하게 사용되고 있는 생물공정기법이다. 생촉매반응은 기질에 대한 입체특이성 및 위치특이성이 탁월하고 대부분의 반응이 환경 친화적 조건에서 일어난다는 장점을 가지고 있다. 그런데 이러한 반응을 산업적으로 활용하기 위해서는 고효율 생촉매반응의 구축이 무엇보다 중요하다. 특히 반응에 사용이 되는 특정 미생물의 생존력과 효소의 안정성 등은 반응의 효율성을 결정짓는 매우 중요한 인자이다. 반응이 진행됨에 따라 일어나는 다양한 환경적 변화에 의해 박테리아나 효모 등의 미생물의 성장이 저해될 수 있고 특정 미생물 내에서 발현되는 효소 또한 안정성이 떨어질 수 있다. 미생물과 효소가 반응에 효율적으로 참여하지 못하면 궁극적으로 생산성이 떨어지기 때문에 이 두 가지 요소가 반응의 효율성에 매우 핵심적인 역할을 한다. 그러므로 본 연구에서는 궁극적으로 생촉매반응의 효율성을 향상시키기 위해 전세포 기반 생촉매반응에 대표적으로 이용되고 있는 효모(Saccharomyces cerevisiae)와 박테리아(Escherichia coli)가 특정 반응 동안 겪는 스트레스에 대한 대사적 반응을 탐구하였고 이들의 내성을 향상시킬 수 있는 인자를 탐색하였다. 또한 케톤기를 가진 기질에 산소를 첨가하는 반응(oxygenation)을 담당하는 효소인 Baeyer-Villiger monooxygenase(BVMO)의 안정성을 떨어뜨리는 인자를 탐색하고 이를 향상시키기 위한 연구를 진행하였다. 첫 번째로 S. cerevisiae를 이용한 에탄올 생산 생촉매 반응의 효율성 향상을 위한 기반 연구를 수행하였다. 최근에 목질 계 생물자원으로부터 에탄올을 과량 생산하는 반응의 경제성을 높일 수 있는 동시당화발효공정(Simultaneous Saccharification and Fermentation; SSF)구축 관련 연구가 활발히 진행되고 있다. 더불어 효율적인 SSF를 위한 내열성 효모의 발굴 및 개발이 필수적이다. 그러므로 본 연구에서는 효모를 최적성장온도인 30℃외에 최대 42℃에서 배양하였을 때 이러한 고온 환경에 대한 효모의 대사적 변화 및 반응에 대해 탐구하였다. 배양온도의 증가에 따라 효모의 성장 속도가 비례적으로 감소하였다. 반면에 스트레스 강도에 비례하여 1 g 세포당 포도당 흡수속도가 증가하였고 보호제로 작용하는 글리세롤과 발효산물(에탄올, 아세트산) 생산속도가 모두 증가하였다. 탄소 흐름 분석 결과, 호기적 조건에서 ATP를 과량 생산할 수 있는 전자전달계와 연동되는 TCA 회로 또한 스트레스 조건에서 활성화되는 것으로 추정되었다. 스트레스를 받게 되면 생존에 필요한 유지 에너지 (maintenance energy)와 손상 회복에 필요한 여러 보조 인자들 (NADH, NADPH 등)의 요구량이 급격히 증가하기 때문에 이를 공급하기 위해 위와 같은 대사적 변화들이 유발된 것으로 사료되었다. 그러나 에탄올과 아세트산에 의해 세포 내 활성산소가 추가적으로 유발되기 때문에 이 대사산물들의 생산 활성화는 효모의 성장에 부정적 영향을 미친다. 특히 고온일 때 소량의 아세트산으로 인해 효모의 성장이 크게 억제될 수 있다. 즉 고온의 스트레스를 받게 되면 단순히 고온에 의한 저해효과뿐만 아니라 에탄올 및 아세트산과 더불어 활성산소의 복합적인 저해효과가 함께 일어나는 것으로 밝혀졌다. 그러므로 효모의 내열성을 향상시키기 위해서는 다각도의 접근이 필수적이다. 두 번째로 재조합 E. coli를 생촉매로써 이용하여 기능성 지방산을 생산하는 반응의 효율성을 향상시키는 연구를 수행하였다. 선행연구에서 구축된 다단계의 생물전환반응을 통해 재조합 E. coli 로부터 중쇄지방산의 헵탄산과 하이드록시 지방산이 생산될 수 있다. 그러나 헵탄산의 강한 독성작용으로 인해 재조합 E. coli의 성장이 억제되고 반응이 일정 농도 이상 진행되지 못하는 문제점이 있기 때문에 본 연구에서는 헵탄산의 독성 작용에 대한 E. coli의 유전자적 및 대사적 변화를 파악하였다. 그 결과 낮은 pH 스트레스(예, 고농도 HCl 스트레스)에 의한 세포 손상을 극복하기 위해 우선적으로 활성화되는 것으로 알려진 glutamic acid-dependent acid resistance(GDAR) 시스템이 헵탄산 스트레스 극복에도 중요한 역할을 하는 것으로 판명되었으나 본 연구에서 사용하는 B계열 E. coli내에서는 활성화되지 못 하는 것이 관찰되었다. 그러므로 GDAR을 활성화시켜 헵탄산에 대한 내성을 높이고자 이 시스템 활성화에 필수요소인 rcsB와 dsrA유전자를 이 균주에 도입시켰다. 그 결과 HCl과 헵탄산에 대한 내성이 모두 증가하였고 궁극적으로 이 재조합 E. coli 기반 생촉매 반응으로부터 하이드록시 지방산의 생산이 약 60 % 증가하여 궁극적으로 반응의 효율성을 향상시킬 수 있었다. 두 번째 연구에서 사용된 재조합 E. coli로부터 기능성 지방산을 생산할 때 반응에 참여하는 효소들의 안정성이 이 반응의 효율성을 결정짓는 또 다른 인자이다. B 계열의 E. coli내에 Micrococcus luteus 유래의 alcohol dehydrogenase(ADH)와 Pseudomonas putida 유래의 BVMO를 동시 발현시켜 장시간 동안 반응을 진행하게 되면 특히 BVMO의 안정성이 크게 떨어져서 생산성이 감소하게 된다. 그러므로 세 번째 연구에서는 BVMO 효소의 안정성과 밀접한 관련이 있는 인자의 탐색을 바탕으로 안정성을 향상시키고 궁극적으로 반응의 효율을 높이고자 하였다. BVMO에 의해 oxygenation반응이 일어나는 동안 유발되는 활성산소에 의해 BVMO 구조가 손상을 받아 이 효소의 활성이 급격히 떨어지는 것을 관찰하였다. 특히 BVMO active site내에 있는 302번의 Cys이 활성산소에 의해 산화되는 것이 BVMO 안정성과 밀접한 관련이 있을 것이라 예상되어 이 잔기를 엔지니어링 대상으로 선정하였다. Cys302가 Leu으로 치환된 BVMO는 산화적 스트레스에 대한 내성이 크게 높아졌고 상온에서도 그 활성을 치환되기 전의 BVMO에 비해 상대적으로 높게 유지할 수 있었다. 또한 이 효소를 발현시킨 재조합 E. coli를 장시간 반응에 이용했을 때 BVMO의 활성이 안정하게 유지되어 생촉매의 효율을 성공적으로 향상시킬 수 있었다. 본 연구에서는 생촉매 반응의 기본적인 이해를 바탕으로 특정 반응의 생산성을 높일 수 있는 방안들을 탐색하였다. S. cerevisiae로부터 에탄올을 얻는 반응과 재조합 E. coli로부터 기능성 지방산을 얻는 반응을 본 연구의 모델 반응으로 선정하였고 각 반응의 효율성을 높이기 위해 ‘미생물의 생존력 증가 및 효소의 안정성 향상’이라는 두 가지 방향으로 접근하였다. 이러한 연구들을 통해 각 반응들의 효율성을 향상시킬 수 있었고 앞으로 다양한 생촉매 반응의 생산성 향상에 기여할 것으로 기대된다.