Structure modeling-based engineering of Baeyer-Villiger monooxygenase to improve the catalytic activity and stability

Abstract

Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMOs) are remarkable biocatalysts that catalyze the oxidation of ketones into esters using NADPH and oxygen [1]. BVMO-mediated regiospecific conversions of ketones can lead to the formation of “normal” or “abnormal” ester products. BVMOs can be applied for the production of high-value fine chemicals such as bioplastic monomers and chiral pharmaceutical intermediates [2-4]. Unfortunately, the BVMOs generally have low activity and stability, because H2O2 can be formed from decay of the peroxy-flavin intermediate [1]. This hydrogen peroxide may oxidize amino acids inside the enzymes and thereby reduce the enzyme activity. In this study, in silico analysis of the enzyme structure was used to find engineering targets to improve the activity and stability of the BVMOs. First, we engineered BVMO from Pseudomonas putida KT2440 (Pp-BVMO) with higher normal regioselectivity, to increase the catalytic activity toward keto-fatty acids. This was based on a Pp-BVMO variant (i.e., BVMO_C302L/M340L/M380L), which had been constructed in previous studies. In detail, the substrate affinity was enhanced by increasing the hydrophobicity of amino acids adjacent to the fatty acid tail. Mutation was also performed to change the hydrophobic amino acid near the carboxyl group of the substrate to hydrophilic. The quadruple mutant (i.e., BVMO_C302L/M340L/M380L_S397A) showed ca. 2-fold higher substrate affinity and resulted in a 3-fold increase in activity, as compared the wild-type enzyme. Next, we conducted a study to improve oxidative stability of BVMO from Pseudomonas fluorescens DSM 50106 (Pf-BVMO), which produces abnormal product from 10-keto-octadecanoic acid. The Caver program allowed to predict the H2O2 migration path in the BmoF1. Based on the enzyme access tunnels for H2O2 migration, the hot-spot residues in tunnels were engineered to improve oxidative stability. Susceptible amino acids to oxidation (i.e., Met and Cys) was exchanged to less susceptible one (i.e., Leu). As a result, a variant with approximately 2-fold increased oxidative stability than the wild type was obtained.;Baeyer-Villiger monooxygenase(BVMO)는 NADPH와 산소를 사용하여 케톤을 에스테르로 산화시키는 반응을 일으키는 생촉매입니다. BVMO의 위치특이적 전환은 "normal" 또는 "abnormal" 에스테르 생성물을 형성할 수 있습니다. BVMO는 바이오 플라스틱 단량체 및 키랄 중간체와 같은 고부가가치 정밀 화학 물질의 생산에 적용될 수 있습니다. 불행히도, BVMO는 일반적으로 낮은 활성과 안정성을 가지고 있습니다. 그 이유는 반응 중간체인 퍼옥시-플라빈의 붕괴로부터 과산화수소가 형성될 수 있기 때문입니다. 이 과산화수소는 효소 내부의 아미노산을 산화시켜 효소 활성을 감소시킬 수 있습니다. 이 연구에서는 효소 구조의 in silico 분석을 통해 BVMO의 활성과 안정성을 향상시키기 위한 엔지니어링 타겟을 선정했습니다. 먼저, 우리는 케토 지방산에 대한 촉매 활성을 증가시키기 위해 normal 위치 선택성을 갖는 Pseudomonas putida KT2440(Pp-BVMO)의 BVMO를 엔지니어링 했습니다. 이것은 이전 연구에서 구성된 Pp-BVMO 변이체(즉, BVMO_C302L/M340L/M380L)를 기반으로 수행되었습니다. 구체적으로, 지방산 말단과 인접한 아미노산의 소수성을 증가시켜 효소와 기질 친화성을 향상시키고자 하였습니다. 또한, 기질의 카르복실기 부근의 소수성 아미노산을 친수성으로 바꾸기 위한 돌연변이도 수행하였습니다. 4중 돌연변이체(즉, BVMO_C302L/M340L/M380L_S397A)는 3중 돌연변이체 효소에 비해 기질 친화도가 약 2배 더 높고 활성이 3배 증가했습니다. 다음으로 10-keto-octadecanoic acid로부터 abnormal 생성물을 생성하는 Pseudomonas fluorescens DSM 50106(Pf-BVMO 또는 BmoF1)으로부터 BVMO의 산화안정성을 향상시키기 위한 연구를 수행하였습니다. CAVER 프로그램을 사용해 BmoF1에서 H2O2 이동 경로를 예측하였습니다. 효소 내 H2O2의 이동에 사용되는 것으로 예측된 터널을 기반으로 터널 내부 핫스팟 잔기물을 산화 안정성을 개선하도록 mutation하였습니다. 산화에 민감한 아미노산(즉, Met 및 Cys)은 덜 민감한 아미노산(즉, Leu)으로 교환되었습니다. 그 결과, 야생형보다 산화 안정성이 약 2배 증가한 변이체를 구축할 수 있었습니다.