Macronutrient distribution in diets affects circadian clocks potentially via induction of ER stress

Abstract

Macronutrient distribution in diet in addition to energy intake is critical for our body to sense and adapt to nutrient availability and to determine metabolic response and its consequential health status. Acceptable macronutrient distribution range as one of dietary recommendations for public health has been set for adequate intake of essential nutrients and reduced risk of chronic disease. However, multiple studies suggested that diets emphasized on various macronutrient distributions have positive effects on weight loss, glucose regulation, and longevity and other studies showed the conflict results. Therefore, it is necessary to examine effects of dietary macronutrient distribution by the parameters which reflect integrative physiological function. Circadian clock regulates physiological and metabolic homeostasis as response to external stimuli with 24 hours rhythm which primarily controlled by suprachiasmatic nucleus in hypothalamus and transmitted as electric signals to peripheral tissues. Monitoring of circadian clock can be a useful biomarker indicating health status and longevity because the circadian clock exists every cell in the whole body and is linked with physiological function and metabolic homeostasis. We hypothesized that dietary intakes with different macronutrient distribution might affect central and peripheral clocks. In this study, we investigated effects of dietary intakes with different macronutrients distribution on regulation of circadian clock and a potential mechanism by which the imbalanced macronutrient intake modified circadian clock using 〖mPer2〗^Luc knock in mice model. Firstly, we showed that nutritional challenge with HFD and LPD changed hypothalamic expression of central clock and clock-controlled genes using publicly available data. The impacts on circadian regulation were also confirmed in the liver, although dietary-modulated CCGs were distinct depending on tissues. Through KEGG pathway analysis, we identified ER stress response pathway as a potential mediating mechanism. In particular, low protein composition triggered changes in oscillation rhythm of ER stress response genes and their downstream metabolic genes such as Fgf21 and Pck1. On the contrary, high protein composition did not show differences from normal chow diet in terms of phenotypic and molecular metabolism, except increased Atgl expression. In consistent with in vivo data, ER stress induction in AML12 cell up-regulated expression of Clock and Bmal1 (p<0.001) and advanced peak phase of Per2. These results suggested that nutritional challenge with outranged macronutrients distribution influenced circadian clock and ER stress response was identified as a potential mediator by which macronutrient distribution impacted on circadian clock regulation. Further investigation is needed to find out how ER stress influences regulation of circadian rhythm and to fully understand effects of macronutrient distribution using more biomarkers and more various distribution. ;식사 내 다량영양소의 에너지 섭취비율은 우리 신체가 활용할 수 있는 영양상태를 감지하고 적응하는데 중요한 역할을 하며, 이와 관련된 대사적 반응과 건강 상태를 결정하는 요인으로 작용한다. 그러므로 적절한 영양소 섭취와 만성질환 예방을 위해, 탄수화물, 단백질, 지방의 에너지 적정 섭취비율은 영양소 섭취기준의 하나로 활용되어 왔다. 그럼에도 불구하고, 에너지 적정 섭취비율을 벗어난 저지방식, 저탄수화물식, 고단백식, 케톤식 등 다양한 다량영양소의 섭취패턴이 체중조절, 당조절 기능 향상, 수명연장 등을 보인다는 긍정적인 연구결과가 일부 발표되고 있다. 그러나 이러한 결과는 비만이나 당뇨 등 대상자의 특성이나 중재 기간 등에 따라 달리 나타나고, 중재의 효과를 판정하기 위해 이용된 지표들도 신체 기능 일부에 국한되어 있어 일관성이 매우 낮다. 따라서 대사적, 생리적 기능을 통합적으로 판정할 수 있는 지표를 활용한 다량영양소 섭취비율의 영향에 대한 연구가 필요하다 판단된다. 최근 생체시계 조절에 대한 기전 연구가 활발히 이루어지며, 노화와 같이 생체기능의 시스템적 변화를 설명할 수 있는 지표로서 그 활용가치가 주목을 받고 있다. 체내 대부분의 세포에 존재하는 생체시계(Circadian clock)는 24시간의 주기성을 가지며 외부 환경의 변화에 반응하여 체내 생리적 기능과 대사적 항상성에 밀접히 관여하므로 건강상태와 수명 등 생체기능의 시스템적 변화를 나타낼 수 있다. 최근 생체시계가 식사 시간이나 빈도 등 식사 요인에 의해 영향을 받는다는 연구결과가 보고되고 있다. 그럼에도 불구하고, 다량영양소의 섭취비율이 생체시계조절에 미치는 영향과 그 기전에 대한 연구는 매우 제한적이다. 따라서, 본 연구는 다량영양소 섭취 비율이 생체시계의 주기에 영향을 줄 것이라는 가설을 설정하고, 연구자들에게 개방되어 있는 오믹스 데이터 분석과 〖mPer2〗^Luc 생쥐 모델과 세포모델 실험을 통해 다량영양소 섭취 비율이 생체시계 주기조절에 미치는 영향을 확인하고 다량영양소의 섭취가 생체시계를 조절하는 기전에 관여하는 경로를 탐색하고자 하였다. 개방 데이터의 2차 가공분석을 통해 고지방식과 저단백질식과 같은 영양적 스트레스가 시상하부와 간의 생체시계 유전자의 발현을 변화시킨 다는 것을 확인하였다. 생체시계 유전자의 조절 표적이 되는 하부의 유전자들의 조합은 시상하부와 간에서 달라 조직특이성을 보였다. 〖mPer2〗^Luc 생쥐 모델에 정상식, 고지방식, 저단백질식, 고단백질식을 6주간 중재하고 PER2 발현을 기준으로 실시간 모니터링을 한 결과, 고지방식와 저단백질식은 PER2의 주기성과 주기 기간, 그리고 고점시간을 변동시켰으며, 특히 저단백질식에서 두드러졌다. 이와 달리 고단백질식은 지방분해에 작용하는 Atgl 유전자의 발현 증가를 제외하고는, 정상식과 생체시계조절이나 다른 대사적 표현형에서도 유의적 차이를 나타내지 않았다. 시상하부와 간의 전사체 데이터의 KEGG 경로 분석을 통하여, 소포체 스트레스 반응의 하위 경로가 공통으로 영향을 받았음을 확인하였다. 이러한 변화는 특히 네 가지 다량영양소 섭취비율 식사 중재 중 저단백질식을 섭취한 그룹의 간 조직에서 유의적으로 나타났다. 저단백질식 중재에서 소포체 스트레스 반응 경로 유전자 중 Ddit3와 Ppp1r15a의 발현이 유의적으로 증가하였을 뿐 아니라, 이 경로의 하부 표적으로 기존에 발표된 바 있는 Fgf21과 Pck 유전자 발현의 주기성 또한 유의적으로 영향을 받았다. 저단백질식으로 유도된 소포체 스트레스가 실제로 생체시계 주기조절에 영향을 주었는가를 확인하기 위해 간세포주인 AML12 세포모델을 이용하였다. Thapsigargin을 처리하였을 때 Atf4 발현 증가로 소포체 스트레스 반응을 확인하였고, 이에 따라 Clock과 Bmal1의 발현이 증가하였고(p < 0.001), Per2는 발현의 최고점이 나타나는 시점이 앞당겨졌다. 따라서, 본 연구결과는 시상하부뿐 아니라 말초조직, 특히 간조직에서의 생체시계주기가 다량영양소 섭취 비율, 특히 저단백식과 고지방식 섭취에 의해 영향을 받을 수 있다는 것을 밝혔고, 특히 저단백식은 영양적 스트레스로 소포체 스트레스 반응을 유발하여 생체시계 주기 조절에 관여할 수 있는 것을 확인하였다는 것에 의의를 가진다. 그럼에도 불구하고 어떻게 소포체 스트레스가 생체시계 주기 조절에 관여하는지에 대한 연구와 보다 다양한 섭취비율과 생체적 지표를 활용한 다량영양소 섭취의 영향에 대한 연구가 추가로 필요하다.