Engineering of Glyoxylate carboligase from Escherichia coli and its application for the production of glycolic acid

Abstract

Formaldehyde (HCHO) is an emerging C1 source, because it could be prepared from CH4, CH3OH, CO, and CO2 by biological and/or chemical means. Therefore, we select formaldehyde as a start material to biosynthesize glycolic acid which can be use monomers of biocompatible polymers and important material in the cosmetic industry. Glyoxylate carboligase from Escherichia coli K-12 (EcGCL) was discovered recently for the condensation of two molecules of formaldehyde into one molecule of glycolaldehyde. EcGCL has higher thermostability than other carboligating enzymes such as FLS, which synthesizes three molecules of formaldehyde into dihydroxyacetone, is known as an enzyme with excellent catalytic efficiency. However, the wild type EcGCL showed a catalytic efficiency (kcat/KM) of 1.6 M−1·s−1 which is low for industrial usage. The catalytic efficiency was enhanced by engineering of the active site and substrate entrance site based on crystal structures and substrate docking simulation. Glyoxylate which is original substrate of EcGCL is more polar and bigger than formaldehyde. A mutant construction strategy was developed based on the fact that glyoxylate, the original substrate of glyoxylate carboligase, has a higher polarity than formaldehyde. In addition, we attempted to lessen product inhibition using tunnel structure analysis. Referring to this, we construct a variety of mutants and EcGCL_R484M/N283Q/L478M/M488L exhibited the catalytic efficiency of 9.2 M−1·s−1. This value is ca. 6-fold greater than that of the wild type EcGCL and almost same with glycolaldehyde synthase, which was previously reported to catalyze the reaction. In vivo biotransformation of EcGCL and its mutants was studied. Unfortunately, the efficiency of whole-cell conversion of triple mutant was higher than quadruple mutant. As a result, in this experiment, a triple mutant (i.e., EcGCL_R484M/N283Q/L478M) was used to build a co-expression biocatalyst for glycolic acid biosynthesis. The EcGCL_R484M/N283Q/L478M was successfully coupled with aldehyde dehydrogenase (AldA) from E. coli for the synthesis of glycolic acid. In vivo biotransformation of EcGCL and AldA allowed producing glycolic acid to a conversion of 52%. This study will contribute to the environmentally friendly synthesis of C2 chemicals such as glycolaldehyde and glycolic acid from formaldehyde. ;포름 알데하이드는 다양한 C1 gas(CH4, CH3OH, CO)로부터 생물학적으로나 화학적으로 얻을 수 있는 물질이기 때문에 기질로 사용할 때 이점이 있어 새로운 탄소원으로 각광받고 있다. 따라서 본 연구에서는 포름 알데하이드를 시작 물질로 하여 글리콜 산을 만드는 생합성 과정을 구축하고자 하였다. 글리콜 산은 바이오 플라스틱의 단량체로 사용될 수 있고 또 화장품 산업에서도 중요한 소재로 알려져 있다. 카보라이게이즈인 Escherichia coli K-12 유래 glyoxylate carboligase (EcGCL)는 최근 포름알데하이드 두분자를 하나의 글리콜 산으로 축합하는 활성이 밝혀졌다. 본 신규 효소는 보고된 포름알데하이드 축합 활성 효소인 formolase(FLS)와 비교하였을 때 굉장히 높은 내열성을 가지고 있다. FLS는 formaldehyde 세분자를 축합하여 하나의 dihydroxyacetone을 만들어 내며, 높은 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 하지만 신규 EcGCL의 경우 전환 효율(kcat/KM)은 1.6 M−1·s−1이며 이는 산업적으로 이용되기엔 매우 낮다. 따라서 효소 촉매 부위와 기질의 입구 부분을 기질-효소 결합체의 구조 분석과 효소 자체의 구조를 분석하여 엔지니어링을 진행했다. 본래 EcGCL의 기질은 Glyoxylate로 포름 알데하이드보다 극성이 높다. 따라서 이러한 특성을 이용하여 극성이 낮은 기질의 반응이 용이하도록 엔지니어링 구축 전략을 세웠다. 추가로 구조 분석을 통해 생성물에 의한 독성에 내성을 가질 수 있도록 터널 구조 분석도 진행했다. 이를 통해 네 개의 잔기가 교체된 EcGCL_R484M/N283Q/L478M/M488L 효소 개량체를 구축하였고 이 개량체는 효소의 전환효율이 9.2 M−1·s−1로 wild type보다 약 6배 좋아진 결과를 얻을 수 있었다. 하지만 세포내 활성을 비교하였을 때 구축된 quadruple mutant보다 세 개의 잔기가 교체된 EcGCL_R484M/N283Q/L478M의 전환율이 높게 나타났다. 따라서 본 연구에서는 triple mutant와 lactaldehyde dehydrogenase(AldA) 두가지 효소를 하나의 세포 내에 발현시켜 포름알데하이드로부터 글리콜산을 생합성 하는 생촉매를 구축하였고 그 전환율은 52%였다. 본 연구는 지속가능한 방법으로 C1화합물에서 고부가 가치의 글리콜알데하디드 및 글리콜산과 같은 C2 화합물을 생합성 하는데에 기여하며 글라이콜알데하이드의 전구체로써의 가능성을 보여준다고 사료된다.