Comprehensive investigation on the bioformations of metabolites in fermentative microorganisms using metabolomics approach

Abstract

During fermentation, diverse metabolites, which are related to sensory properties of fermented foods, are produced by various microorganisms through their metabolisms. In particular, the formation of volatile metabolites is significantly affected by microbial species or strains, and fermentation conditions, including cultivation temperatures, periods, nutrients, and pH level. In this study, mass spectrometry (MS)-based metabolomic approach was applied to investigate the changes of metabolite profiles depending on fermentative microbe and conditions in food (fermented soybeans and rice) and model systems (chemically defined media). Also, volatile and non-volatile metabolites that contribute to the distinctive metabolic expressions were assigned to specific fermentative microbes and fermentation conditions. In this study, the effects of microbial species on the formation of volatile and non-volatile metabolites in fermented soybeans (chapter 2) and fermented rice (chapter 3) were investigated. Fermented soybeans and rice were prepared by different single microbial starter [e.g., molds, yeasts, lactic acid bacteria (LAB), and other bacteria]. In fermented soybeans, the metabolic patterns of fungi group (Aspergillus oryzae, Rhizopus oryzae, Saccharomyces cerevisiae, and Pichia anomala) were clearly separated from bacteria group (Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Lactobacillus fermentum, and Lactobacillus plantarum). In particular, the formation of branched-chain aliphatic alcohols and esters increased in the fungi group, while that of volatiles derived from fatty acids was superior in the bacteria group. On the other hand, fermented rice inoculated by molds (A. oryzae and R. oryzae) showed more activated metabolic profiles to form volatile metabolites compared to other samples, which were prepared by lactic acid bacteria (L. paratarum and L. fermentum) and yeasts (S. cerevisiae and P. anomala). Also, the formation of some metabolites, which was associated with specific microorganism, was determined. Branched-chain volatiles were strongly linked to Aspergillus oryzae, while Lactobacillus plantarum showed strong relationship with acetic acid compared to other microorganisms. In the case of study in non-food system, it was focused on the effects of culture conditions in fermentative microorganisms on the formation of metabolites. In chapter 4, two strains of Aspergillus oryzae (AOB/AOK) with different activities of hydrolytic enzymes, such as α-amylase, protease and lipase, were used to investigate the effects of different culture conditions, such as temperature, fermentation time, and initial pH, on the formation of intracellular and extracellular metabolites. In this study, fatty acids and volatile metabolites derived from fatty acids and amino acids were highly related to AOK with higher protease and lipase activities, whereas sugars, sugar alcohols, and carbohydrate-derived volatiles were the main metabolites of AOB with higher α-amylase activity. Also, the temperature and initial pH were critical factors for the generation of primary and secondary volatile metabolites, such as organic acids, fatty acids-derived volatiles, and some amino acids, in both A. oryzae strains. In chapter 5, Bacillus licheniformis was selected to determine the changes of transcriptome and metabolome depending on different culture conditions, such as alkaline pH (BP) and high salt concentration (BS). Transcriptome and metabolome responses of B. licheniformis were successfully annotated. Overflow metabolism, amino acid metabolism, and the defense system of extracellular stress (e.g. synthesis of RNA and sporulation) were activated in both BS and BP compared to control (BC). Several metabolites, such as some amino acids (proline, serine, and cysteine), branched-chain amino acids-derived volatiles (2-methylpropanoic acid and 3-methylbutanoic acid) and corresponding gene expressions (e.g. aldehyde dehydrogenase, amino acids synthesis) were significantly different according to culture conditions. In particular, in leucine metabolism, the formation of 3-methylbutanoic acid, which has strong cheesy and rancid odor note, was highly increased in BP compared to other samples. These studies demonstrated that fermentative microorganisms and fermentation conditions were closely related to the formation of metabolites, using metabolomics analysis. Metabolomics us useful technology to better understand biological phenomena, however, it has still limitation and challenges due to high biological variance in metabolite levels. In this study, comprehensive metabolic approach, such as combination with transcriptomic analysis or assay of enzyme activity, were applied to overcome these limitation and could provide more meaningful biological information about fermentative microorganisms.;발효 과정 동안 발효식품의 감각적 특성과 관련된 휘발성 대사 산물은 일차 및 이차 대사 과정 모두에서 발생되는 부산물로 이는 발효 미생물의 대사과정에 의해 생성된다. 그리고 휘발성 대사산물의 생성은 미생물의 종류, 발효 온도, 시간, 영양소, pH 수준 등의 배양 조건에 의해 크게 영향을 받는다. 본 연구에서는 식품 (발효 콩과 발효 쌀)과 비식품 (합성 배지) 시스템에서 질량분석학과 대사체학을 기반으로 발효 미생물 및 발효 조건을 기인하여 생성되는 대사체 프로파일링의 변화를 조사하였다. 또한, 특정 발효 미생물 및 발효 조건에 상응하여 생성되는 특정 휘발성 및 비휘발성 대사체를 확인하였다. 본 연구의 연구 2와 3은 각각 발효 콩과 발효 쌀에서 발효 미생물이 대사체 생성에 미치는 영향에 대해 연구하였다. 발효 콩과 발효 쌀은 각각 곰팡이, 효모, 유산균, 박테리아 발효 균주를 한 종류씩 접종 및 발효하여 시료를 준비하였다. 발효 콩에서는 전반적인 대사체의 생성 패턴이 곰팡이 그룹 (Aspergillus oryzae, Rhizopus oryzae, Saccharomyces cerevisiae, and Pichia anomala)과 박테리아 그룹 (Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Lactobacillus fermentum, and Lactobacillus plantarum)으로 구분되는 것을 확인하였다. 특히 가지형 알코올과 에스테르류가 곰팡이 그룹에서는 증가한 반면, 지방산 유래 휘발성 대사체들은 박테리아 그룹에서 생성이 우세하였다. 한편 발효 쌀에서는 곰팡이류 (A. oryzae, R. oryzae)가 효모 (S. cerevisiae, P. anomala)나 유산균 그룹 (L. paratarum, L. fermentum)보다 휘발성 대사체의 생성량이 우세한 것으로 나타났다. 발효 콩과 마찬가지로 발효 쌀에서도 발효 미생물의 종류가 휘발성 대사체 생성에 크게 영향을 미쳤다. 예를 들어 가지형 휘발성 대사체의 생성에는 A. oryzae가 생성이 우세한 반면, 유산균의 경우 acetic acid 의 생성이 다른 균주에 비해 관련이 깊은 것으로 나타났다. 비식품 모델에서는 발효 미생물의 배양 조건에 따른 대사체 생성의 변화에 초점을 맞추었다. 연구 4에서는 α-amylase, protease, lipase 의 다른 종류의 가수분해 효소 활성을 가진 두 종류의 A. oryzae의 배양 시간, 배양 온도, pH 수준에 따라 셀 내/외의 대사체 생성의 변화를 연구하였다. 연구 결과, 상대적으로 높은 protease와 lipase 활성을 지난 AOK는 지방산과 지방산 유래 휘발성 대사체 생성과 높은 관련을 보였고, 높은 α-amylase 활성을 보인 AOB는 당, 당알콜, 탄수화물 유래 휘발성 대사체 생성과 관련이 높은 것으로 나타났다. 또한 두 균주 모두 배양 조건 중 발효 온도와 pH는 일차와 이차 대사산물 중 유기산, 지방산 유래 휘발성 대사체, 그리고 몇몇 아미노산의 생성과 연관성을 보였다. 연구 5에서는 Bacillus licheniformis 의 pH (BP)와 염농도 (BS)에 따른 전사체와 대사체의 변화를 연구하였다. BP와 BP는 대조구에 비해 overflow 대사과정, 아미노산 대사과정, 외부 스트레스 방어 기작 중 하나인 RNA 및 내성 포장 합성 과정이 활성화 되었다. 그리고 몇몇 대사체들, 아미노산 (proline, serine, cysteine), 가지형 아미노산 유래 휘발성 대사체 (2-methylpropanoic acid, 3-methylbutanoic acid)과 이들의 생성에 관여하는 유전체 (aldehyde dehydrogenase, 아미노산 합성) 등이 배양 조건에 크게 영향을 받았다. 특히 루신 대사과정에서, 강한 cheesy하고 rancid한 향 특성을 지닌 3-methylbutanoic acid가 BP에서 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 본 연구들을 대사체학을 기반으로 발효 미생물과 발효 조건이 특정 대사체의 생성과 밀접하게 관련 있다는 것을 확인하였다. 직관적으로 세포 내 대사체를 정량하여 연구하는 방법은 세포의 대사과정을 연구하는 데 있어 가장 핵심적인 방법이나, 정확한 정량의 어려움, 다양한 효소들의 직간접적인 영향 등으로 인해 정확한 생물학적 결론을 도출하기 어려울 수 있다는 한계가 있다. 본 연구에서는 전사체 분석 및 효소 활성 특정 등의 다양한 종류의 데이터를 대사체 데이터와 통합 분석하여 이러한 한계점을 극복하고 보다 유의미한 생물학적 정보를 도출하였다.