Oxygenase-Based Whole-Cell Biotransformation of Fatty Acids into Industrially Relevant Oleochemicals

Abstract

Oils and fatty acids are renewable and eco-friendly bioresources. Since they can be used as starting materials for the production of industrial relevant chemicals, biotransformation of unsaturated fatty acids into oleochemicals by using oxygenase-based recombinant Escherichia coli biocatalysts were investigated. The first biotransformation was to produce medium-chain fatty acids such as (R)-3-hydroxynonanoic acid, 9-hydroxynonanoic acid, and 1,9-nonanedioic acid from renewable long-chain fatty acids. The biotransformation was driven by enzyme/whole-cell biocatalysts, consisting of the esterase of Pseudomonas fluorescens and the recombinant E. coli expressing the secondary alcohol dehydrogenase (SADH) of Micrococcus luteus, the Baeyer-Villiger monooxygenase (BVMO) of Pseudomonas putida KT2440 and the primary alcohol/aldehyde dehydrogenases (ChnDE) of Acinetobacter sp. NCIMB9871. Engineering of the enzyme/whole-cell biocatalysts allowed to produce the target products (R)-3-hydroxynonanoic acid, 9-hydroxynonanoic acid, and 1,9-nonanedioic acid from ricinoleic acid to a rate of over 20 U/g dry cells and to a conversion of ca. 70%. The second biotransformation was to produce long-chain aliphatic amines and esters from renewable fatty acids (e.g., ricinoleic and oleic acid). Long-chain aliphatic amines (i.e., (S,Z)-heptadec-9-en-7-amine and 9-aminoheptadecane) were synthesized by whole-cell biotransformation using the combination of an SADH, an engineered amine transaminase from Vibrio fluvialis (Vf-ATA), and a photoactivated decarboxylase from Chlorella variabilis NC64A (Cv-FAP) in a one-pot process. Also, long chain aliphatic esters (i.e., 10-(heptanoyloxy)dec-8-ene and octylnonanoate) were produced by coupling of the SADH, BVMO, and the Cv-FAP. The amines and esters were produced at rates of up to 37 U/g dry cells, and with conversions up to 90%. The third biotransformation was to synthesize the secondary fatty alcohols (e.g., 6S-hydroxy-(7E,9Z)-heptadecadiene (6-HHD)) from linoleic acid via hydroperoxy fatty acid and hydroxy fatty acid. The recombinant E. coli was engineered to express 13S-lipoxygenase from Pseudomonas aeruginosa (Pa-LOX) and Cv-FAP. The engineered strain allowed conversion of 200 mM linoleic acid to 161 mM 13S-hydroperoxy-(9Z,11E)-octadecadienoic acid at a rate of 890 U/g dry cells. The target product, 6-HHD was produced from linoleic acid through the chemo/enzymatic cascade transformation, consisting of dioxygenation of linoleic acid by intracellular Pa-LOX, reduction of the hydroperoxy fatty acid by tris(2-carboxyethyl)phosphine, and decarboxylation of the hydroxy fatty acid by Cv-FAP to a conversion of ca. 74% in a one-pot process. This study will contribute to the valorization of long-chain renewable fatty acids into industrially relevant chemicals. ;오일 및 지방산은 재생가능하며 친환경적인 생물자원으로 바이오 연료 및 플라스틱의 단량체, 유화제, 계면활성제, 코팅제를 비롯한 산업적 유용 화합물을 생산할 수 있다. 재생 가능한 오일 및 지방산의 대표적인 고부가가치화 방법으로는 효소 반응을 기반으로 한 생물 전환이 있다. 따라서, 본 연구에서는 불포화 지방산으로부터 산소화 효소를 기반으로한 생물 전환 반응 경로를 통해 고부가가치 산물을 생합성 하고자 하였다. 연구 2에서는 리시놀레산으로부터 (R)-3-hydroxynonanoic acid, 9-hydroxynonanoic acid와 1,9-nonanedioic acid와 같은 중쇄 카복실산으로 전환하는 생합성 경로를 설계하였다. 구축한 생물 전환 경로는 P. fluorescence 유래 esterase 효소 및 S. maltophilia 유래 hydratase, M. luteus 유래 alcohol dehydrogenase (ADH), 및 P. putida KT2440 유래 Baeyer-Villiger monooxygenase (BVMO), Acinetobacter sp. NCIMB9871 유래 primary alcohol/aldehyde dehydrogenase (ChnDE)를 도입한 대장균 기반 전세포 생촉매를 이용한 효소/전세포 생촉매를 이용하여 진행되었다. 이를 이용해 리시놀레산으로부터 (R)-3-hydroxynonanoic acid, 9-hydroxynonanoic acid와 1,9-nonanedioic acid로 전환하였으며, 20 U/g dry cells의 속도로 70 % 이상 전환하였다. 연구 3에서는 리시놀레산과 올레산으로부터 장쇄 지방족 아민 및 에스터를 생합성하였다. 재생 가능한 지방산들로부터 장쇄 지방족 아민 (즉, (S,Z)-heptadec-9-en-7-amine 및 9-aminoheptadecane)을 생합성 하기 위해 ADH, V. fluvialis 유래의 개량된 amine transaminase (ATA), C. variabilis 유래 photodecarboxylase (CvFAP)를 이용하였다. 또한, 에스터 (즉, 10-(heptanoyloxy)dec-8-ene 및 octylnonanoate)를 생합성 하기 위해 ADH, BVMO 및 CvFAP를 이용 하였다. 장쇄 지방족 아민 및 에스터는 최대 37 U/g dry cells의 속도로 생산되었으며, 최종적으로 90% 이상 전환되었다. 연구 4에서는 리놀레산으로부터 히드로퍼옥시 지방산 및 히드록시 지방산을 거쳐 이차 지방 알코올인 6S-hydroxy-(7E,9Z)-heptadecadiene (6-HHD)을 생합성 하였다. 이를 위해 P. aeruginosa 유래 13S-lipoxygenase (PaLOX)및 CvFAP를 도입한 재조합 대장균을 구축하였다. PaLOX를 도입한 생촉매는 200 mM의 리놀레산으로부터 890 U/g dry cells의 속도로 161 mM의 13S-hydroperoxy-(9Z,11E)-octadecadienoic acid (13-HOD)로 전환하였다. 최종 목표 산물인 6-HHD는 리놀레산으로부터 PaLOX의 이산소화 반응, 환원제 (TCEP)에 의한 환원반응 및 CvFAP의 탈카복시화 반응 즉, 화학/효소 전환반응을 통해 74%의 전환율로 생산되었다. 이러한 효소 기반의 전세포 생촉매 생물전환 반응들은 재생 가능한 지방산들로부터 산업적으로 유용한 고부가가치 산물들을 생산하는데 기여할 것으로 기대된다.