Glutamine Deprivation-triggered G2/M Cell Cycle Arrest via Regulating KDM5B and ER Stress in Lung Cancer Cells

Abstract

Glutamine is a non-essential amino acid, however, it becomes crucial for cancer cells as an alternative energy source. Although its deprivation has been known to lead to impairment in cell proliferation, the underlying mechanism is not fully understood. In this study, we hypothesized that a short-term glutamine deprivation in non-small cell lung cancer (NSCLC) induced the cell cycle arrest via decreased alpha-ketoglutarate (AKG) and subsequently reduced Lysine (K) demethylase 5B (KDM5B) activity. We investigated whether and how lack of glutamine in culture media impacted on cell cycle regulation and its upstream pathways. First, we confirmed the cell viability was significantly reduced upon glutamine deprivation condition. The reduction involved the G2/M cell cycle arrest, shown by significant reduction of cyclinB1 and induction of P21, rather than apoptosis. The cell cycle arrest was linked to DNA double strand break (DSB), showing increased protein expression of γH2A.X. Next, differentially expressed gene (DEG) analysis was performed on the previously published data from lung cancer cells with glutamine depletion. It revealed that ER stress response and unfolded protein response (UPR) were top candidate pathways in gene ontology and geneset enrichment analysis, respectively. The ATF4 gene and its downstream DDIT3 and TRIB3 genes increased in glutamine-depleted cell lines, which was validated by quantitative reverse transcription PCR (RT-PCR). The results indicated that glutamine deprivation triggered the ER stress via ATF4 pathway, possibly leading to genome instability and G2/M cell cycle arrest. Next, we tested that the ER stress induction was mediated by hampered KDM5 activity, which depends on AKG. Glutamine depletion resulted in increased level of histone H3 lysine K4 trimethylation (H3K4me3), due to reduction of KDM5B activity. To prove the involvement of KDM5B, we checked molecular markers for cell cycle arrest and DSB, using small interfering RNA (siRNA) targeting KDM5B. The KDM5B knockdown indeed recapitulated reduction of cyclinB1 and induction of γH2A.X. The mRNA expression of ER stress markers was also induced upon KDM5B knockdown. Taken together, the results suggested that glutamine deprivation prompted ER stress, subsequently leading to sustained DSB and G2/M cell cycle arrest by repression of KDM5B activity and increase of H3K4me3. These results uncovered a novel mechanism by which NSCLC cells with lack of glutamine were arrested, suggesting glutamine metabolism and KDM5B as potential therapeutic targets for NSCLC. ;글루타민은 암세포의 생존과 증식을 위해, 필요한 에너지를 공급하고 TCA 회로의 중간물질을 공급하는 주요한 아미노산이다. 글루타민의 결핍이 세포의 세포 성장을 저해한다고 알려져 있으나, 그 분자적 기전에 대해서는 여전히 명확히 밝혀지지 않은 부분이 많다. 본 연구는 단기간의 글루타민 결핍이 비소세포폐암 세포에서 세포주기를 교란하는 메커니즘을 확인하고자 진행되었으며, 글루타민 결핍으로 인한 세포주기교란이 알파-케토글루탐산 부족으로 초래된 KDM5B의 억제를 통해 일어난다고 가설을 설정하였다. 비소세포폐암 세포주인 A549와 H1299 모두에서 글루타민을 결핍 시켰을 때 세포 생존이 뚜렷하게 감소하는 것을 확인하였다. 이는 세포사멸로 인한 것이 아니라, G2/M phase세포주기 정지로 인한 것이었으며, 이는 cyclin B1의 감소 및 그의 상위 기전인 P21의 감소로 확인되었다. 글루타민 결핍 시 γH2A.X가 증가하여 세포주기 정지는DNA 이중 가닥 손상과 관련되어 있음을 확인할 수 있었다. 글루타민 결핍 시 변화된 유전자들이 관여하는 공통적인 후보 경로를 확인하기 위해 GEO데이터를 이용하여 재가공 및 분석을 진행하였다. 그 결과, Gene ontology분석에 의하면 소포체 스트레스와 관련된 유전자들의 발현이 유의적으로 증가하였고, GSEA를 통해 경로분석을 한 결과 이와 유사하게 UPR 관련 경로임이 확인되었다. 이를 바탕으로 정량적으로 검증한 결과, 소포체 스트레스 관련 유전자인ATF4 및 그 하위 유전자인 DDIT3, TRIB3의 mRNA수준은 글루타민을 결핍한 세포에서 모두 증가되었다. 반면, 소포체 스트레스 관련 경로 중 ATF6 경로에 관여하는 유전자인 XBP1의 발현은 유의적인 변화를 보이지 않았다. 또한 genome instability의 마커인 GADD45A의 유전자 발현을 확인하였을 때, 글루타민을 결핍 시킨 군에서 증가됨이 확인되었다. 이를 통해 글루타민 결핍이 ATF4 경로를 통한 소포체 스트레스와 관련이 있으며, 이로 인해 유도된 genome instability가 G2/M phase 세포주기 정지를 유도한다는 결론을 도출할 수 있었다. 이러한 변화가 알파-케토글루탐산 의존 효소인 KDM5B의 효소 활성감소와 관련되어있는지 검증하기 위해 KDM5B의 표적인 H3K4me3의 단백질 수준을 측정하였다. 글루타민 결핍 시H3K4me3는 증가하여 histone demethylase 인 KDM5B의 효소활성이 감소되었을 가능성을 보였다. 글루타민 결핍으로 인해 유도된 G2/M phase 세포주기 정지가 KDM5B의 영향을 받았는지 확인하기 위해 siRNA를 이용해 KDM5B의 발현이 억제된 세포를 이용하여 위의 마커들을 확인하였다. KDM5B 발현 억제 시, 예상대로 γH2A.X의 단백질이 증가되었고 이의 상위경로인 소포체 스트레스와 관련된 ATF4와 그 관련 유전자들 역시 글루타민을 결핍 시켰을 때와 매우 유사하게 유전자 발현이 증가되었다. 이를 토대로 글루타민 결핍으로 유도된 세포주기 정지는 KDM5B의 활성 감소로 증가된 ATF4 및 하위 유전자 발현 때문이라는 결론을 도출하였다. 본 연구는 비소세포폐암 세포에서 글루타민 결핍이 KDM5B의 활성을 감소로H3K4me3를 증가시켰음을 확인하였고 이는 ER 스트레스를 증가시켜 G2/M상 세포주기교란이 일어나는 기전을 보였다. 이러한 연구는 글루타민의 세포내 효용을 조절할 수 있는 KDM5B나 이와 관련된 소포체 스트레스 인자들이 암 치료 표적이 될 수 있음을 시사하며, 차후 KDM5B와 소포체 스트레스경로의 관련 기전에 대한 연구가 추가로 필요하리라 사료된다.