Characterization and Engineering of Novel PhospholipaseA2s Originating from Marine Microorganisms including Sciscionella marina

Abstract

Phospholipase A2 (PLA2) is a lipolytic enzyme, which can be used in a wide range of industrial applications including production of lysolecithins and enzymatic degumming of edible oils. However, its catalytic activity and thermal stability are not high enough for the industrial applications. Therefore, new PLA2 candidates were explored in the pool of marine microorganisms which are known to survive in harsh environments. In specific, isolation and characterization of the PLA2s from Marinactinospora thermotolerans (Mt), Sciscionella marina (Sm), and Verrucosispora maris (Vm) were investigated. The new PLA2s share about 40 to 60 % sequence identity with Streptomyces violaceoruber (Sv) PLA2. After construction of Escherichia coli-based microbial cell factory for production of the new PLA2s using PelB signal sequence for protein export, characteristics of new PLA2s such as optimal pH, optimal temperature and their thermal stability was examined. Among diverse PLA2s, SmPLA2 and MtPLA2 are relatively thermally stable at 50 ℃ and 60 ℃. The smPLA2 had the highest thermal stability but the activity was rather low. Thereby, SmPLA2 was engineered to improve specific activity. I have performed sequence alignment and the structural analysis of SmPLA2 homology model. It supposed that one residue of Ca2+ binding site substitution to other amino acid may improve the activity. Variants were constructed by site-directed mutagenesis method. One of the SmPLA2 variants, S38G showed significantly improved activity and thermal stability. Characterization of the SmPLA2 structure will be investigated to verify the reaction mechanisms and other properties.;포스포라이페이스A2 (PLA2)는 레시틴의 두 번째 위치하는 지방산 에스터 결합을 가수분해하여 라이소레시틴과 지방산으로 분해하는 효소이다. 이때 생성되는 라이소 레시틴은 레시틴보다 향상된 유화 기능을 가지게 되며, 식품뿐만 아니라 의약품, 화장품 산업에서 널리 이용될 수 있다. 또한 PLA2는 식용 오일의 디거밍 과정에서 이용된다. 효소를 생물 촉매로 이용하여 유용한 물질을 생산하는 생물 공정에 있어서 가장 중요한 것은 효소의 안정성이다. 특히, 고온에서 이루어지는 생물 촉매 반응이 저온에서 이루어지는 효소 반응에 비하여 상대적으로 생산수율이 높은 것으로 알려져 있으므로, 생물공정에서 효소의 열 안정성은 상당히 중요한 문제이다. 게다가, 고온의 효소 반응은 상온이나 저온에서의 반응에 비하여 효소의 기질 용해도가 높고, 미생물 오염이 감소되며, 용액의 점성이 감소하는 등의 장점이 있기 때문에, 열 안정성이 높은 효소의 개발은 생물공정 및 이를 응용한 산업에 매우 유용하다. 따라서 본 연구에서는 PLA2를 생물 공정에 적극적으로 활용하기 위하여, 척박한 환경에서 생존하고 있는 해양 미생물 유전체 정보를 통해 신규 PLA2들을 발굴하였다. 선정된 신규 PLA2는 Marinactinospora thermotolerans (Mt), Sciscionella maria (Sm), Verrucosispora maris (Vm) PLA2이다. 신규 PLA2 들은 대장균을 기반으로 생산되었으며 내열성 실험 결과 SmPLA2 와 MtPLA2가 50, 60 ℃의 고온에서 내열성을 갖는 것으로 확인되었다. 그중 내열성이 가장 높았던 SmPLA2의 다소 낮은 활성을 향상시키기 위한 엔지니어링을 진행하였다. SmPLA2의 homology model을 구축한 후에 구조를 분석하였으며, Ca2+binding sites에 존재하는 한 개의 아미노산이 다르다는 것을 관찰하였다. 따라서, site-directed mutagenesis 방법을 이용하여 variants를 구축하였다. 그중 SmPLA2 S38G의 경우 기존 SmPLA2에 비해 활성이 증가하였으며 높은 내열성은 유지하였다. PLA2들 중 가장 활성이 높은 SvPLA2와 저농도의 기질에서는 유사한 활성을 보였으나, 고농도에서는 SvPLA2에 비해 높은 활성을 보이는 것으로 확인되었다. 이러한 높은 활성과 내열성을 가지는 SmPLA2 S38G는 다양한 산업에서 유용하게 이용될 것이다.