Beta-carotene exerts anti-colon cancer stem cells effects by regulating DNA methylation and histone acetylation

Abstract

Colorectal cancer (CRC) is the thirdly most diagnosed cancer and has the second highest mortality in the world. Cancer stem cells (CSCs) are the small population of cancer cells having self-renewal ability and tumor initiation capability. Moreover, CSCs have resistance to cancer treatments such as radiation therapy and chemotherapy. This characteristic of CSCs contributes to cancer recurrence. Due to the high recurrence rate of CRC, it is important to investigate the anti-cancer mechanism targeting CSCs. Epigenetic modifications are inheritable alterations occurred without changing in DNA sequence. The representative epigenetic modifications include histone modification, DNA methylation, and miRNA regulation. Recent study has suggested the effect of BC on CSCs in neuroblastoma, However, anti-cancer stemness effect of beta-carotene (BC) by regulating the epigenetic mechanisms is poorly understood. Therefore, this study investigated epigenetic regulation of BC in colon CSCs. Double staining of CD133 and CD44 which known as colon CSC markers were conducted in HCT116 cells and sorted by FACS. The result of sphere formation assay showed that BC suppressed self-renewal capacity in colon CSCs. miRNA sequencing data has investigated that BC regulated miRNAs associated with histone acetylation. Consistently, BC up-regulated the protein expressions of global histone H3 and H4 acetylation., To evaluate the effect of BC on DNA methylation, DNMT expressions was performed by qPCR and global DNA methylation level was identified by ELISA. As a result, BC down-regulated the mRNA expression of DNMT3A. Also, significant decrease of the global DNA methylation was exhibited in BC or AZA-treated group. Furthermore, mRNA expression of BCO1 which recently exhibited its anticancer effect on CSCs was determined to investigate the potential demethylation effect of BC on tumor suppressor gene. Although BC tended to increase the expression of BCO1, BC did not show the statistically significance. In addition, pyrosequencing data exhibited that there was no significant change on promoter CpG methylation level of BCO1 by BC treatment. Taken together, our findings demonstrated that BC has potential to regulate miRNAs, increase histone acetylation., and down-regulate the DNA methylation levels in colon CSCs. In conclusion, this study proposed the anti-cancer effects of BC through histone acetylation and global DNA methylation on colon CSCs. ;대장암은 전 세계에서 세번째로 흔히 발병되는 암이며, 암 중에서 사망률이 두번째로 높다. 암세포들 중에서 작은 집단에 속하는 암줄기세포는 자가복제능력과 종양형성능력을 갖고있다. 또한 암줄기세포는 방사선치료나 약물치료 등의 암치료 방법에 저항성을 갖고있으며, 이는 암 재발의 원인이 된다. 대장암은 암 재발률이 높은 암이기 때문에 암줄기세포를 표적으로 하는 치료기전을 규명하는 일이 중요하다. 후성유전학적 기전이란 DNA 염기서열의 변화없이 조절되는 유전적 변형을 의미한다. 대표적인 후성유전학 조절기전에는 DNA 메틸화, 히스톤 변형, microRNA 조절이 있다. 암 발생 및 치료에 대하여 후성유전학적 연구는 많이 되어있으나, 베타카로틴의 암 조절에 대한 후성유전학적 연구는 부족하다. 또한, 베타카로틴의 암줄기세포 조절과 대장암조절에 대한 연구는 있으나, 베타카로틴이 대장암 줄기세포에 미치는 항암 기능에 대한 연구는 많이 되어있지 않다. 따라서 본 연구에서는 베타카로틴이 대장암줄기세포에 미치는 영향을 후성유전학적으로 연구하였다. 이를 규명하기 위해 대장암줄기세포에 베타카로틴을 처리하는 세포실험을 진행하였다. 대장암 세포주 HCT116 중, 암줄기세포 마커인 CD133과 CD44를 모두 발현하는 세포들만 형광이용세포분류기 (FACS)를 통해 분리하였다. 베타카로틴 처리에 따른 대장암줄기세포의 자가복제능력이 저하됨을 구 형성 분석법 (sphere formation assay)으로 확인하였다. miRNAs 시퀀싱 분석법을 통해 베타카로틴이 miRNA를 조절하여 대장암줄기세포의 히스톤 단백질 아세틸화를 증가시켰음을 규명하였다. 베타카로틴 처리에 따른 히스톤 변형을 확인하기 위하여, 아세틸화된 히스톤 H4와 H3의 단백질 발현을 측정하였다. miRNA 시퀀싱 분석과 동일하게, 베타카로틴의 처리에 따른 아세틸화된 H3와 H4의 발현 증가를 확인하였다. DNA 메틸기전달효소 중 DNMT1과 DNMT3A의 mRNA 발현을 측정하였으며, DNMT3A만이 베타카로틴 처리에 따라 감소됨을 확인하였다. 전반적인 DNA 메틸화 정도를 효소면역분석법 (ELISA)을 통해 측정하였으며, 감소한 DNMT3A의 결과와 동일하게 베타카로틴 처리에 따른 전반적인 DNA 메틸화의 감소를 확인하였다. 또한, 항암효능의 기전이 연구된 BCO1의 mRNA 발현이 베타카로틴 처리시 증가하는 것을 확인하였다. BCO1의 발현 증가를 프로모터의 CpG 메틸화 감소로 추정을 하여 DNA 파이로시퀀싱 분석법을 통하여 BCO1의 프로모터 CpG 부위의 메틸화 변화를 확인하였다. 파이로시퀀싱 분석 결과 베타카로틴 처리에 따른 BCO1의 프로모터 CpG 메틸화의 감소가 유의적으로 보이지 않았음을 확인하였다. 이러한 결과들을 바탕으로, 본 연구에서 후성유전학 기전인 miRNA 조절과 히스톤 아세틸화 및 DNA 메틸화를 통하여 베타카로틴이 대장암줄기세포를 억제함을 최초로 규명하며 이를 통한 베타카로틴의 대장암 예방 및 치료에 과학적 근거자료로 사용됨을 기대한다.