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Comparison of volatile and non-volatile metabolites produced by Rhizopus oryzae JJ3-9 and KCCM35485 according to cultivation conditions

Title
Comparison of volatile and non-volatile metabolites produced by Rhizopus oryzae JJ3-9 and KCCM35485 according to cultivation conditions
Authors
오수민
Issue Date
2018
Department/Major
대학원 식품공학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Advisors
김영석
Abstract
다양한 미생물을 포함하고 있는 누룩은 우리나라의 전통 주류인 막걸리의 미생물 스타터로써 사용된다. 특히, 누룩 내 다양한 효소들은 전분을 당화하고 환원당을 생성한다. Rhizopus oryzae는 누룩에서 발견되는 가장 흔한 곰팡이 중 하나이다. R. oryzae JJ3-9에 대한 앞선 연구를 통해 이 균주가 glucoamylase 활성이 높고, 막걸리의 품질을 향상시키는 가능성이 있는 균주라는 것을 확인하였다. 본 연구는 사상성 진균인 R. oryzae JJ3-9와 KCCM35485 (표준균주)에 의해 생성된 비휘발성 및 휘발성 대사체의 프로파일에 대한 시간, 온도, pH와 같은 배양 조건의 영향을 확인하고자 수행되었다. 비휘발성 대사체는 유도체화 후 GC-TOF/MS를 이용하여 분석하였다. 다른 조건에서 배양된 R. oryzae의 휘발성 대사체는 stir bar sorptive extraction (SBSE)방법을 사용하여 추출하고 GC-MS (quadropole)을 이용하여 분석하였다. Principal component analysis (PCA)와 partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA)는 배양 조건에 따른 R. oryzae의 대사체 프로파일의 통계적 차이를 확인하기 위해 이용하였다. 아미노산, 당, 유기산, 지방산을 포함하는 다양한 비휘발성 대사체들이 검출되었다. Ehrlich pathway에 관여하는 isoleucine, valine, phenylalanine과 같은 아미노산은 37℃ 에서 배양했을 때 양이 감소하는 경향을 보였다. 포화 및 불포화 지방산을 포함하는 대부분의 지방산은 32 h 배양한 시료에서 양이 증가하였다. 포화 지방산의 비는 배양 온도가 증가함에 따라 감소하였고, 반면 불포화 지방산의 비는 증가하였다. Fusel alcohols, acetate esters, 지방산 ethyl esters는 시료를 구별하기 위한 주요 휘발성 대사체로 선정되었다. Propan-1-ol, 3-methylbutan-1-ol, 2-phenylethanol과 같은 fusel alcohols은 KCCM35485에 비하여 JJ3-9에서 높은 농도로 검출되었다. 특히, JJ3-9를 37℃ 에서 배양하였을 때 가장 많은 양이 검출되었다. Ethyl acetate, 2-methylpropyl acetate, 3-methylbutyl acetate와 같은 acetate esters는 JJ3-9에서, ethyl tetradecanoate, ethyl pentadecanoate, ethyl hexadecanoate ethyl (Z)-ocatadec-9-enoate (ethyl oleate)와 같은 high molecular weight-chain ethyl esters는 KCCM35485에서 많은 양이 검출되었다. PLS-DA 결과에 의하면, R. oryzae JJ3-9는 배양 조건에 따라 비교적 명확하게 구분이 되는 반면, R. oryzae KCCM35485는 배양 조건에 대한 영향을 적게 받는 것으로 보여졌다.;Nuruk, which contains various microorganisms, is used as a microbial starter of makgeolli, a traditional alcoholic beverage in Korea. In particular, diverse enzymes in nuruk saccharify starch and produce reducing sugars. Rhizopus oryzae is one of the most common fungi found in nuruk. A preliminary study on R. oryzae JJ3-9 demonstrated that it has high glucoamylase activity, and also is a potential strain to enhance quality of makgeolli. This study was conducted to determine the influence of cultural conditions, such as time, temperature and pH, on the volatile and non-volatile metabolites profiles produced by filamentous fungi R. oryzae JJ3-9 and KCCM35485 (a reference strain). Non-volatile metabolites were determined by GC-TOF/MS analysis after a derivatization. Volatile metabolites of R. oryzae cultivated under different conditions were extracted using stir bar sorptive extraction (SBSE) method and analyzed by GC-MS (quadropole). Principal component analysis (PCA) and partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA) were then applied to evaluate statistical differences in the metabolites profiles of R. oryzae samples according to cultivation conditions. Various non-volatile metabolites including amino acids, carbohydrates, organic acids and fatty acids were detected. The levels of amino acids, such as isoleucine, valine and phenylalanine, involved in Ehrlich pathway showed a tendency to decrease when cultivated at 37℃. Most fatty acids, both saturated and unsaturated fatty acids, increased from 24 to 32 h of cultivation time. In addition, the proportion of saturated fatty acids decreased as cultivation temperature increased, whereas unsaturated fatty acids increased. The major volatile metabolites related to the discrimination of samples were fusel alcohols, acetate esters and ethyl esters of fatty acids. Higher levels of fusel alcohols, such as propan-1-ol, 3-methylbutan-1-ol and 2-phenylethanol, were found in JJ3-9 than KCCM35485. In particular, those metabolites were most abundant in JJ3-9 cultivated at 37℃. In addition, the levels of acetate esters such as ethyl acetate, 2-methylpropyl acetate and 3-methylbutyl acetate, were much higher in JJ3-9, while those of high molecular weight-chain ethyl esters, such as ethyl tetradecanoate, ethyl pentadecanoate, ethyl hexadecanoate and ethyl (Z)-ocatadec-9-enoate (ethyl oleate), were considerably higher in KCCM35485. On PLS-DA plot of metabolites, JJ3-9 samples were clearly discriminated according to cultural conditions, whereas KCCM35485 samples were less affected by them.
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