Molecular signatures of aging in muscle

Abstract

Healthy aging has become more important since worldwide population have entered to an aging society. According to WHO, the global average of healthy life expectancy (HALE) is 63.1 years, which is approximately ten years shorter than the expected biological life span. In Korea, the average life span and the healthy life expectancy are 82.3 years and 73.2 years respectively, which show a similar gap to the global average. During this gap, chronic exposure to poor environmental conditions such as unbalanced nutrition intake or environmental pollution increases the susceptibility to age-related diseases. In particular, decline in muscle mass during aging, which is called sarcopenia, affects in a large part of life quality such as daily life independency. Sarcopenia is an age-associated loss of skeletal muscle mass, quality, and strength, whose molecular mechanism is still elusive. In this study, we aimed to investigate the molecular signature of sarcopenia using two independent analyses on human aged muscle samples and rat models. First, secondary bioinformatical analysis was performed on two published datasets (GSE1428 and GSE50498) including gene expression and DNA methylation profiles of human skeletal muscle from old men compared to that from young men. As a result, gene ontology (GO) term analysis revealed that differentially expressed genes (DEGs) and differentially methylated position (DMPs) in aged skeletal muscle were overlapped in GO terms associated with glucose metabolism process, kinases activities, and morphogenesis. Secondly, a rat model using 25-month (mo)-old rats with dietary restriction (DR) as the DR-induced aged muscle (DIAM) model was set and analyzed. DIAM showed dramatic reduction of MyH4 mRNA level in the skeletal muscle, indicating an accelerated aging due to DR. According to GO terms analysis of transcriptional profiles from the DIAM rat model, 93 DEGs were highly associated with pathways regarding to muscle regulation and neuromuscular junction (NMJ). Increased expression of Myog and MuRF1 genes was mainly listed in muscle regulation-related GO terms as a key pathway for muscle degradation in DIAM. Additionally, GO terms regarding pathways related to acetylcholine receptors, postsynaptic elements of NMJ, were significantly associated with the DIAM in rat model. Since altered acetylcholine receptor (AchR) might contribute to muscle denervation and degradation via interaction with increased MuRF1 and/or aberrant replacement of subunits, we confirmed the expression of AchR genes, Chrne or Chrng, using quantitative methods. The association of synaptic transmission was significantly in the results from secondary analysis of human datasets. Interestingly, increased mRNA level of Chrng in aged muscle of rats was associated with the result of secondary analysis showing hypomethylation of the promoter region. In conclusion, the DIAM in rat model revealed that short-term DR during senescence seemed to act as a metabolic stress to muscle and caused NMJ dysfunction in muscle through MuRF1, which is upregulated by Myog. Additionally, NMJ dysregulation may be mediated not only by DR-induced upregulation of MuRF1 but also by DNA methylation–mediated transcriptional changes of Chrng according to the analysis on human muscle dataset.;오늘날, 초고령화 사회에 돌입하게 되면서 노화 관련 질병에 대한 관심은 증대되고 있다. 이는 나이가 들수록 질병에 대한 취약성이 증가하기 때문이며 노화와 높은 연관성을 갖는 질병으로는 당뇨병, 골다공증, 알츠하이머 질병, 그리고 심혈관 질환 등이 있다. 특히 노화 관련 근육 질병인 근감소증은 노인들의 일상생활 속 활동성을 저하시키기 때문에 삶의 질을 떨어트리는 요인이 된다. 하지만 이러한 영향에도 불구하고 근감소증이 발생하는 기전이나 그에 대한 치료법은 아직까지 명확히 밝혀지지 않은 상태이다. 따라서 본 연구에서는 노화된 근육에서의 분자적 신호를 분석하고자 하였으며 이미 발표된 데이터들로부터 분자적 경로들을 추출한 뒤 쥐 모델에서의 분자적 분석을 진행하는 것을 세부목적으로 가졌다. 본 연구는 이미 발표된 데이터들을 2차 가공하여 노인들의 골격근의 유전자 발현 및 DNA 메틸화를 Gene ontology (GO) term을 통해 분석하였다. 그 결과, 포도당 대사 과정, 키나아제 (kinase)의 활성정도, 근육의 형태형성 (morphology)과 관련된 분자적 경로가 노인들의 근육에서 나타나는 것으로 보여졌다. 또한 근육 분화 마커들의 전사 정도를 쥐 모델에서 확인했을 때 6개월령 내에서 식이제한의 영향이 없었던 반면, 25개월령 내에서는 식이제한에 의해 후기 근육 구성물질인 Myosin heavy chain 4 (MyH4)의 전사 정도가 감소되는 것을 확인했다. 이러한 결과를 토대로 본 연구에서는 희생 한 달 전부터 식이제한을 한 25개월령을 쥐 모델을 근육의 노화를 촉진시키는 조건이라고 가정했다. 그 다음, 노화가 촉진된 근육에서의 유전자 발현 데이터를 얻기 위해 microarray 분석을 진행하였다. 그 결과 93개의 특이적으로 발현하는 유전자들 (DEG, differentially expressed gene)이 뽑혔고, 근육 및 신경근 접합부 (NMJ, neuromuscular junction)를 조절하는 경로가 유의하게 관련된 것으로 나타났다. 근육 조절 GO term에 속한 Myog와 MuRF1이, NMJ 관련 GO term에서는 아세틸콜린 수용체 (AchR) 중에서도 엡실론 아단위 (subunit)에 대비한 감마 subunit의 비율이 DR-induced aged muscle (DIAM)에서 증가한 것으로 나타났다. 이러한 결과를 통해 MuRF1과의 상호작용으로 태아 형태인 AchR의 감마 subunit의 발현이 증가하여 NMJ의 이상을 유발함으로써 근감소를 유도할 것이라는 기전을 제시했다. 또한, 앞서 확인한 NMJ의 기능장애의 분자적 기전에 대한 단서를 얻기 위해 DNA 메틸화 데이터인 GSE50498을 2차가공했고, 그 결과 노인군에서 Chrng 유전자, 즉 AchR의 감마 subunit의 DNA 프로모터 부분에 저메틸화가 진행된 것을 확인할 수 있었다. NMJ에서의 변화 외에도, GSE1428과 GSE50498의 2차 가공 결과에서 나타난 포도당 대사 과정과 관련된 유전자에 해당됐던 Hk2의 mRNA 발현 분석을 통해 세포의 포도당 감지 기능이 둔감화된 것을 DIAM에서 확인했으나 나이에 따른 유의한 변화는 없었다. 이는 DIAM의 유전자 발현 프로필로부터 나온 약화된 포도당 유입 조절 GO term에 의해서도 뒷받침된다. 즉, 늦은 시기에 식이제한을 단기간 진행하면 이는 근육에 대사적 스트레스로 작용하는 동시에, NMJ에 있어서의 기능장애로 이어지게 될 가능성이 크고 이는 Myog에 의한 MuRF1의 발현증가에 따른 결과라고 예상된다. 혹은, 식이제한에 의해 촉진된 노화 증상이 태아형태에서만 발현되는 Chrng의 DNA 프로모터 부분에 저메틸화를 진행시킴으로써 NMJ의 분자적 변화를 야기할 가능성도 있는 것으로 사료된다.