Inactivation of Bacillus subtilis spores using intense pulsed light (IPL) according to incubation times

Abstract

Spore-forming bacteria in foods are highly resistant to various stresses so that it is important to inactivate them. Although thermal treatment is an effective inactivation method, it can cause changes in food qualities by high temperature. Intense pulsed light (IPL) is one of the non-thermal techniques that can effectively improve food safety while preserving nutritive quality. In this study, inactivation effects of the IPL on Bacillus subtilis spores with various input voltages and treatment times were evaluated. The inactivation levels of spores increased with the input voltages and the treatment times. IPL treatments at 1200 V and 1400 V for 50 sec (corresponding to total fluences of 4.56 J/cm2 and 7.40 J/cm2) showed 6.1 and 7-log reductions, respectively. This study suggested that the IPL treatment has a potential to inactivate bacterial spores. Furthermore, spores rapidly germinate under appropriate incubation conditions, so it is very important to monitor the change in sensitivity to IPL during this process. According to the results, resistance to IPL temporarily increased until 1 hour after the start of incubation, and gradually decreased when it was longer than 2-3 hours. Optical microscopy, monitoring of optical density and measurement of germination were performed to determine the relationship between IPL sensitivity and spore germination and outgrowth during the incubation. The temporary increase in resistance at the early stage of incubation was estimated to be due to the leakage of dipicolinic acid (DPA) from the spores during the early germination stage. After 1 hour, there was no significant difference in the inactivation effects until 2 hours and thereafter it gradually decreased because the proportion of vegetative cells increased as the incubation time became sufficient.;내생포자는 영양세포에 비하여 열, 화학적 살균 처리, 자외선 등의 다양한 스트레스에 내성이 강해 상당히 높은 온도에서 긴 살균 처리 시간이 요구된다.이러한 과도한 살균은 식품의 품질 저하를 야기하기 때문에 최근 식품의 품질은 유지하면서 안전성을 확보할 수 있는 비가열 살균 연구가 각광받고 있다. 광펄스 기술은 비가열 살균 기술 중 하나로 200 - 1100 nm 파장범위를 갖는 빛을 사용하는 기술로 기존의 UV 살균에 비해 월등히 높은 살균력을 가지는 것으로 알려지고 있다. 본 연구에서는 비가열 살균기술인 광펄스를 활용하여 Bacillus subtilis spore의 광펄스 저감화 효과를 확인하고자 하였다. 800 - 1400 V까지 200 V 간격으로 처리시간을 달리하여 처리한 결과, 전압과 처리시간이 길어질수록 포자의 사멸효과가 증가하는 경향을 보였다. 더 나아가 포자는 식품과 같이 영양분이 존재하면 빠르게 영양세포로 발아, 성장을 하게 된다. 따라서 포자의 발아와 성장 기간 동안에 광펄스에 대한 민감도 변화를 모니터링하는 것은 중요하다. 최대 6시간까지 배양시키면서 광펄스 처리시 민감도 변화를 확인하고 대조군으로 열처리도 진행한 결과, 광펄스와 열처리의 배양 초기의 사멸 경향이 다름을 확인하였다. 열에 대한 저항성은 배양 시작 후 지속적으로 감소하는 반면, 광펄스에 대한 저항성은 30분에서 1시간까지 일시적으로 증가하다가 그 이후에는 점차 저항성이 감소함을 확인할 수 있었다. 6시간까지 배양시킨 포자의 발아, 성장 과정 파악을 위하여 광학 현미경 관측, 600 nm에서 optical density 측정, 발아 비율을 측정한 결과, 배양시작 후 1시간 까지는 발아가 주로 일어나며 1시간 이후에도 발아 개시와 이미 발아가 완료된 포자의 성장이 복합적으로 일어난다고 보여진다. 이때 광펄스 저항성이 일시적으로 증가하는 구간에서는 Stage I germination 단계의 균으로 인한 것으로 추측된다.발아는 두 단계로 나뉘며 발아단계 중 초기 발아 단계에서 가장 주요한 내부 물질의 변화는 바로 포자 내의 디피콜린산(DPA)의 유출이다. 디피콜린산은 자외선의 민감도를 부여하는 물질로 알려져 있으며, 본 연구에서도 포자 안에 축적되어 있던 디피콜린산이 유출되면서 광펄스에 대한 저항성이 초기에 약간 증가한 것으로 판단된다. 2시간 배양 이후에는 약간 저항성이 감소하며 3시간 이후에는 가장 저항성이 높았던 1시간 구간과 비교 시 유의적 차이가 나는 수준에서 저항성이 더욱 감소하였다.이후로 배양시간이 더욱 증가하면 광펄스의 저항성은 더욱 감소하였는데 이는 배양시간이 길어지면서 포자의 발아와 성장이 증가되고 포자보다 저항성이 낮은 영양세포의 비율이 현저히 높아짐에 따라 광펄스 사멸효과가 증가한 것으로 추정되었다. 결과적으로 광펄스가 포자를 효과적으로 저감화할 수 있음을 확인하였고 배양시간에 따라서 배양 초기에는 오히려 광펄스에 대한 저항성이 일시적으로 증가함을 확인하였다. 초기의 저항성이 증가하는 경향은 UV와 유사하지만, 광펄스의 경우 photochemical뿐만 아니라 photophysical 효과로 인한 상승효과가 보다 월등히 일어나므로 UV보다 훨씬 효과적인 균 저감화가 기대된다. 따라서 본 연구를 통해 저항성이 강한 미생물의 포자를 비열살균기술인 광펄스로 저감화할 수 있다는 것을 통해 가열살균을 대체할 수 있는 가능성을 확인하였으며, 더 나아가 실제 식품에 존재하는 포자의 저감화 연구가 이루어진다면 품질과 안전성을 모두 만족시킬 수 있는 신 살균 방법이 될 것이다.