Integration of dsrA and rcsB into Escherichia coli BL21 (DE3) genome using CRISPR-Cas9 system enhances the acid tolerance

Abstract

ω-Hydroxy carboxylic acid is a practical material that can be used as the starting material of nylon, polyester, polyamide synthesis. The ω-hydroxy carboxylic acid was produced from renewable fatty acids through the multistep enzymatic pathway using recombinant Escherichia coli. But, it is difficult process because the produced medium chain fatty acids lower the pH of medium. In this study, acid resistance related genes were integrated into genome of E. coli BL21 (DE3) using CRISPR-Cas9 system to improve acid resistance. Because E. coli BL21 (DE3) does not have regulators to activate glutamic acid-dependent acid resistance (GDAR) system for acid tolerance, dsrA and rcsB, which are key factors in activating GDAR system, were integrated into E. coli BL21 (DE3) genome. The gene will integrated in three different positions in genome, and the position of genomic coordinate of 1,300,270 was the most efficient site to integrate dsrA and rcsB. dsrA/rcsB were successfully expressed in the E. coli BL21 (DE3) dsrA+, E. coli BL21 (DE3) rcsB+ and E. coli BL21 (DE3) dsrA+rcsB+ engineered. The engineered strains expressing dsrA and/or rcsB showed the higher survival rate and specific-growth rate under n-heptanoic acid stress than wild-type E. coli BL21 (DE3).;ω-hydroxy carboxylic acid 는 나일론, 폴리에스터, 폴리아마이드 합성의 시작물질로 이용될 수 있는 실용적인 물질이다. 재조합 대장균을 이용하여 multistep enzymatic pathway 를 통해 renewable 지방산으로부터 생산되는 ω-hydroxy carboxylic acid 는 중쇄지방산인 n-heptanoic acid 와 동량으로 생성된다. 중쇄지방산으로 인해 배지의 pH가 낮아지면 ω-hydroxy carboxylic acid 고수율로 얻기가 쉽지 않다. 그러므로 본 연구에서는 CRISPR-Cas9 system을 이용하여 내산성 관련 유전자를 Escherichia coli BL21 (DE3) genome 에 삽입하여 내산성을 향상했다. E. coli K-12 와 달리 E. coli BL21 (DE3) 는 내산성 시스템인 glutamic acid dependent acid resistance (GDAR) regulator 가 없다. 그러므로 산에 대한 저항성을 향상시키기 위하여 GDAR 시스템의 활성에 중요한 인자인 dsrA와 rcsB를 CRISPR-Cas9 system 을 통해 E. coli BL21 (DE3)에 도입하였다. 3 개의 유전체 위치 중 유전체 좌표 위치가 1300,270인 곳에 dsrA와 rcsB를 삽입할 때 가장 효율적이었다. E. coli BL21 (DE3) dsrA+, E. coli BL21 (DE3) rcsB+ and E. coli BL21 (DE3) dsrA+rcsB+ engineered 에서 성공적으로 발현되었다. dsrA/rcsB가 도입된 균주는 wild type E. coli BL21 (DE3) 비하여 n-heptanoic acid stress 하에서 높은 생존율과 비성장속도를 보였다.