Metabolic network modeling and in silico analysis of bacterial physiology for biorefinery

Abstract

Understanding cell physiology is essential to develop a powerful biocatalyst for the biosynthesis of fuels and chemicals. In this dissertation, metabolic network modeling was used to systematically analyze cell physiology including carbon and energy metabolism of a thermophile Thermus thermophilus HB27, a hexanoic acid producer Megasphaera elsdenii, and the conventional microorganisms Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum. In Chapter 2, genome-scale metabolic network model of T. thermophilus HB27 was reconstructed and constraints-based flux analysis was carried out to investigate the thermotolerant mechanisms and cellular metabolism. Metabolic network modeling revealed several distinctive metabolic reactions, mainly in amino acid metabolism and carotenoid biosynthetic pathway, which involved in producing relevant compounds to retain the cellular membrane for withstanding high temperature. The comparative flux analysis highlighted that the cells consumed branched-chain amino acids preferably and utilized them directly in the relevant anabolic pathways for fatty acid synthesis. In Chapter 3, a genome-scale metabolic model of M. elsdenii, iME346, was reconstructed. The comparative analysis of the carbon metabolism with other volatile fatty acid producers including Clostridium acetobutylicum and C. kluyveri revealed features of the carboxylic acids metabolism. Notably, crotonyl-CoA could be produced through two different pathways in M. elsdenii and C. kluyveri: from pyruvate via oxaloacetate and succinate or from pyruvate via acetyl-CoA and acetoacetyl-CoA. The oxaloacetate and succinate pathway, which was not observed in C. acetobutylicum, appeared to be involved in production of hexanoic acid from succinate. Substrate affinity of both the acetyl-CoA C-acetyltransferase (Thl) and the acetyl-CoA hydrolase/transferase (Cat) seems to be important in hexanoic acid productivity. In Chapter 4, metabolic network modeling of E. coli and C. glutamicum growing in a glucose mineral medium containing various amounts of cyclohexanone showed that the fermentative pathway to acetic acid was significantly activated by cyclohexanone addition in E. coli. However, carbon flux into TCA cycle was markedly increased in C. glutamicum compared to its fermentation pathway. These results suggested that solvent stress metabolism and acid tolerance mechanism of the bacterial cells are different. The regulatory mechanisms should remain to be investigated. This study may contribute to understanding and engineering of bacterial catalysts for biorefinery.;생촉매를 이용한 생물연료와 바이오 화학제품의 생산을 위해서는 세포 생리를 이해하는 것이 우선이다. 이 논문은 호열성 균주 Thermus thermophilus, 헥사노익산 생산 균주 Megasphaera elsdenii, 연구와 산업에 많이 사용되는 균주 Escherichia coli 와 Corynebacterium glutamicum의 탄소와 에너지 대사경로를 포함한 세포 생리 전반을 대사 네트워크 모델링을 이용하여 체계적으로 분석하였다. 연구 2에서는 T. thermophilus에 대하여 게놈 차원의 대사 네트워크 모델을 구축하였고, 이 모델을 이용하여 내열성 기제와 세포 생리 연구를 위한 제약 기반 흐름 분석을 하였다. 대사 네트워크 모델을 구축하는 과정에서는 아미노산, 카로티노이드 등 고온에서 세포막의 구조를 유지시키는 물질들이 생성되는 대사에 있어 특이한 생화학 반응들을 찾았다. 또한 비교 흐름 분석을 통해서는 세포가 기질로 분기사슬 형태의 아미노산들을 다른 아미노산들보다 선호하며 이 아미노산들이 분기사슬 형태의 지방산 합성에 사용되는 사실을 확인하였다. 연구 3에서는 M. elsdenii에 대하여 게놈 차원의 대사 네트워크 모델을 구축하였다. 휘발성 지방산 생산 균주 Clostridium acetobutylicum과 Clostridium kluyveri의 탄소 대사과정과 M. elsdenii를 비교하여 카르복시산 대사의 특징을 확인하였다. M. elsdenii와 C. kluyveri는 부티르산 합성의 중간체인 크로토노일 조효소A를 두 가지 경로를 통하여 생산한다. 첫 번째 경로는 피루비산염으로부터 옥살로아세테이트와 숙신산을 거치는 경로이고, 두 번째 경로는 피루비산염으로부터 아세틸 조효소A와 아세토아세틸 조효소A를경유하는 경로이다. 헥사노익산 생산에 있어서는 C. acetobutylicum에서 발견되지 않은 옥살로아세테이트와 숙신산을 거치는 경로가 관련이 있을 것으로추정된다. 또한 아세틸 조효소A 아세틸기전달효소와 아세틸 조효소A 가수분해효소/전이효소의 기질 친화력이 헥사노익산의 생산성에 중요할 것으로 예상된다. 연구 4에서는 E. coli와 C. glutamicum에 대하여 포도당을 포함하는 최소배지에 다양한 농도의 시클로헥사논을 첨가하여 배양하였고, 이 결과를 이용하여 대사 네트워크 모델로 대사 흐름 분석을 진행하였다. E. coli에서는 첨가한 시클로헥사논의 농도가 증가할수록 아세트산 발효 경로가 활성화되었고, C. glutamicum에서는 TCA 회로의 탄소 흐름이 증가하는 경향을 보였다. 이와 같은 결과는 용매 스트레스와 산 스트레스에 대한 세포 대사 변화가 다르다는 것을 보여준다. 향후에는 용매 스트레스 조절 메커니즘에 관한 연구가후속되어야 할 것으로 보인다.