Modulatory effects of persimmon vinegar and its fractions on alcohol-induced inflammatory stress and CYP2E1 expressions in the liver of Wistar rats

Abstract

This study was aimed to demonstrate protective effects of persimmon vinegar (PV) and its fractions in chronically alcohol drinking rats. Forty male Wistar rats (six-week-old) were divided to five groups (n=8/ group); normal control (NC), ethanol control (ET), PV concentrate (PT), ethanol-insoluble fraction of PV (PI) and ethanol-soluble fraction of PV (PS) plus ethanol administration groups. The treatment materials were given by oral administration at dose of 100 mg/ kg B.W. respectively, 2 hours before ethanol treatment. Simultaneously, ethanol (50%, v/v) was treated orally with sequential increase dose (2.5, 4, 5 and 6 ml/ kg B.W., per week) for 4 weeks. Hepatic gene expressions of Interlekin-1β (IL-1β) and toll-like receptor 4 (TLR4) were significantly decreased in PI and PS compared to ET (P=0.0076 and P=0.0142). In addition, gene expressions of interleukin-12β (IL-12β) and cyclooxygenase-2 (COX-2) in all treatment groups significantly decreased in liver tissue (P=0.0009 and P=0.0003). Furthermore, hepatic mRNA expression of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) had a tendency to decrease in all treatment groups than the ET group, but there was no significantly difference among all groups. The protein expression of cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) was significantly increased in the ET group compared to the NC group. PT treatment significantly suppressed ethanol-induced CYP2E1 activation in the liver (P=0.0452). Similarly, PI and PS treatment had a tendency to decrease in CYP2E1 expression than that of the ET group, but there was no significantly difference. In the liver, histological analysis revealed the ethanol-induced mild steatosis grade, whereas all treatment groups prevented hepatic steatosis compared to the ET group. Taken together, our study show that PV and its fractions had a protective effect on chronically ethanol consumption induced liver inflammation and oxidative stress via modulating hepatic immune response system and alcohol metabolism enzymes activities. PV and its fractions had a potent via regulate ethanol induced LPS-TLR4 signaling pathway related pro-inflammatory cytokines and mediator production. In addition, PT significantly attenuated alcohol-induced CYP2E1 activation than other fractions. The present findings suggest that PV and its fractions had a hepatoprotective effect against ethanol-induced inflammation and oxidative stress via regulation of alcohol metabolism and anti-inflammatory response system.;본 연구에서는 감식초 농축액 (PT) 및 감식초를 에탄올 침전법으로 분획한 에탄올 불용성 분획물 (PI) 및 에탄올 가용성 분획물(PS)의 알코올 스트레스에 대한 간 내 항염증 및 알코올 대사에 대한 효능을 알코올을 4주간 1일 1회 경구투여한 동물 모델을 통해 규명하고자 하였다. 수컷 Wistar-Kyoto 계 흰쥐 (6주령)를 대상으로 4주간 매일 감식초 농축액(PT), 감식초 에탄올 불용성 분획물(PI), 감식초 에탄올 가용성 분획물(PS)을 각 100mg/kg. B.W으로 경구투여 하였으며, 2시간 후 50% 에탄올을 경구투여 하여 알코올 스트레스로 인한 간 손상을 유도하였다. 간 조직의 형태학적 분석에서 에탄올 대조군(ET)과 비교하여 감식초 농축액 및 에탄올 불/가용성 분획물 투여군에서 간 조직 내 지방의 크기가 작고 분포가 적은 것으로 확인되었다. 산화적 스트레스에 의한 손상을 나타내는 혈액 및 간에서의 지질과산화물의 수준에서는 모든 군 간 유의적인 차이를 보이지 않았다. 또한, 알코올 스트레스에 대한 항산화 효소 활성을 확인해본 결과, 간 내 SOD, CAT and GSH-Px 에서 모든 군 간에 유의적인 차이를 보이지 않았으며, 적혈구 CAT에서 PI 와 PS 군이 에탄올 군에 비하여 활성이 증가하는 경향을 보였지만 통계적으로 유의적인 차이는 없었다. 간 조직에서 알코올 스트레스에 대한 염증 대사 발현 인자를 확인하고자 quantitative real-time-transcription polymerase chain reaction (qPCR)을 이용하여 TNF-α, IL-6, interleukin-1β (IL-1β), interleukin-12 (IL-12β), toll like receptor-4 (TLR 4), CD14, monocyte chemoattractant protein–1 (MCP-1), Macrophage inflammatory protein (MIP-2), cyclooxygenese-2 (COX-2)의 발현 정도를 측정하였다. 그 결과 염증성 사이토카인인 IL-1β에서 PI 및 PS군에서 ET군과 비교하여 그 발현이 유의적으로 감소하였으며, IL-12β에서 모든 감식초 투여군에서 ET군에 비해 그 발현이 유의적으로 감소하였다. COX-2의 발현 역시 모든 감식초 투여군에서 ET군에 비해 그 발현이 현저하게 감소하였다. 또한, 에탄올에 의한 LPS 자극으로 유도되는 TLR4 수용체의 발현 역시 ET군에 비하여 PI 및 PS군에서 유의적인 감소를 보였다. 간 내 에탄올 대사과정의 주요 효소인 cytochrome P450 2E1(CYP2E1)의 단백질 발현을 측정한 결과, ET군이 NC군에 비해 발현이 유의적으로 증가하였다. 또한, PT군의 발현이 PI와 PS를 투여한 군에 비하여 CYP2E1의 발현이 유의적으로 감소됨을 확인하였다. 본 연구 결과들을 통해, 4주간의 에탄올 경구투여는 알코올 대사 효소의 발현 증가와 간 내 염증성 사이토카인 및 염증 인자의 생성을 촉진하였으며, 이에 대해 감식초 농축액 및 그 분획물의 투여가 에탄올 섭취로 유도되는 LPS/ TLR4 신호 매게 전달 경로와 관련된 염증성 사이토카인 및 관련 인자를 조절함으로써 면역 기전 조절의 가능성이 있을 것으로 사료된다. 더욱이 감식초 농축액 (PT)의 투여는 에탄올 대사과정에 있어 주요 효소로 작용하는 CYP2E1의 단백질 발현을 억제하였으므로 알코올 대사 효율에 있어 감식초의 가능성을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 연구 결과들을 근거로 향후 추가적인 연구를 통해 감식초 농축액 및 그 분획물의 투여가 에탄올 섭취로 유도되는 LPS/TLR4 신호 전달과정에서 NF-κB 활성과 관련된 구체적인 기전 확인이 필요할 것으로 사료된다.