A two-step quantitative detection of food-borne pathogens based on capillary electrophoresis-single-strand conformation polymorphism coupled with multiplex PCR and its application in food system

Abstract

The rapid and effective detection and identification of food-borne pathogens is important not only in controlling and investigating food-borne diseases but also for improving food safety and management in the food industry. A parallel analysis method using capillary electrophoresis-based single-strand conformation polymorphism (CE-SSCP) combined with specific PCR was developed for detection of multiple pathogens associated with food poisoning. A novel two-step technique involving multiplex PCR and CE-SSCP analysis for identification of pathogens followed by singleplex PCR quantification was also performed. The important eight food-borne pathogens, including Salmonella enterica, Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica, Vibrio parahaemolyticus, and Escherichia coli O157 were analyzed and simultaneously identified by CE-SSCP coupled with multiplex PCR. Subsequently, the identified pathogens were quantified using singleplex PCR with specific primer. The specific primers were targeted to lipopolysaccharide O-antibody (rfbE) gene in Escherichia coli O157 and 16S rRNA genes in other seven pathogens. These primers showed high sensitivity, which can detect small amounts of target DNA (0.2 - 24 pg per μL). This method was applied to food system, cooked rice. A mixture set of grown seven microbes; Salmonella typhimurium, Escherichia coli O157, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Clostrdium perfringens was serially diluted in buffered peptone water (BPW) to having different concentrations, ranging 10³ to 10^(6) CFU per ml of pathogens. They were inoculated into cooked rice sample which was then homogenized with BPW. The genomic DNA of pathogen mixture in the sample was extracted for subsequent analysis with the developed method, CE-SSCP based on multiplex PCR. The detection limit of cell number was 10³ CFU per ml in cooked rice sample. This method only takes less than 5 h to perform, so can be used for rapid investigation of causative agents of food poisoning. Its simplicity and high sensitivity may lead to improved management of food safety.;식중독균의 빠른 검출이 식품 안전에 있어 중요한 이슈임에도 불구하고, 외식과 급식 산업의 증가 등의 이유로 식중독 발생 사례는 꾸준히 증가하고 있다. 기존 전통적인 배양방식에 근거한 식중독균 검출방법은 최종 결과를 얻기까지 며칠의 시간이 소요되며, 분리 배양 및 생화학적 검사 등을 거쳐 정확한 결론을 도출하기 위해 많은 노력이 소요되고 있는 것에 비해 낮은 민감도와 정확성을 보여, 정밀하고 빠른 식중독균 진단법의 개발이 시급하다. 이와 같은 추세에 따라, DNA를 바탕으로 하는 다양한 분자생물학적 기법들이 선보이고 있다. 이 중 다중 증폭 기술 (multiplex PCR)은 다양한 식중독균의 동시적인 분석이 가능케 하며, 각 유전자의 유전적 변이에 따른 2차 구조 차이에 근거한 분리 기술인 단일쇄 형태변환 다형성 (SSCP)를 통해 모세관 전기영동 (CE)에서 이동 속도 차이를 정밀하게 분석할 수 있다. 따라서 본 연구는 주요 식중독균 8 종 Salmonella typhimurium, Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica 그리고 Escherichia coli O157의 16s rRNA gene 및 장출혈성 대장균의 rfbE gene을 대상으로 하는 특이적 프라이머를 사용하여 모세관 전기영동 상에서 동시적 분석하였으며, 생물계통적 게놈 (genomic DNA)과 피크 넓이 간의 높은 선형성을 보이는 상관관계를 그려내 정량분석의 지표를 설정하였다. 또한 식품에서 식중독균의 검출법 확립을 위해 멸균된 밥에 인위적으로 접종한 주요 식중독균 7 종 Salmonella typhimurium, Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica 그리고 Escherichia coli O157이 별다른 증균 과정 없이 모두 10³ CFU/ml 정도의 양이 존재할 시 동시적 검출이 가능함을 본 연구를 통해서 확인하였다. 본 연구는 실제 식품 샘플부터 최종 결과 확인까지 5 시간 미만이 걸리며, 이는 현존하는 다른 분자생물학적 기법들과 비교 시 빠르고 정밀한 분석법이라는 점에서 매우 큰 장점을 가진다. 모세관 전기영동은 높은 분석능과 재현성을 가지고 있으며, 민감하고 정밀한 동시적이고 정량적인 분석을 가능케 하여 전통적인 분석법이 가진 한계를 대신할 방법으로 떠오르고 있다. 본 실험의 분석방법은 식품에서 매우 적은 양의 식중독균이 존재할 시에도 증균 과정 없이 동시적인 분석이 가능함을 보여줘 다양한 식중독균의 분석방법으로 활용될 수 있을 것이다.