Sensitive and simultaneous detection of eight foodborne pathogens by capillary electrophoresis-based single-strand conformation polymorphism coupled with multiplex PCR

Abstract

식품산업에서의 생물학적 안전성 및 식중독 발병에 따른 역학조사에 있어 그 원인 균을 신속하고 정확하게 판별할 수 있다는 것은 매우 중요하다. 그러나 현재 식중독 균의 전통적인 검출방법은 각각의 균 들에 관한 분리배양 과정 및 생화학적 반응과 혈청학적 확인시험 과정이 요구 되기에, 시간적으로는 4일 이상이 소요되며 많은 노동력이 필요한 반면, 민감도와 정확도는 떨어지는 상황이다. 따라서, 본 연구에서는 식중독을 유발하는 주요 8개 균 각각의 16S rRNA 유전자에 반응하는 특이적 유전자 증폭기술(Multiplex PCR)과 모세관 전기영동장치(CE)를 기반으로 한 단일쇄 형태변환 다형성기술(SSCP)을 이용하여 신속하고 효율적이며 동시적으로 식중독 균을 검출할 수 있는 분석방법을 제시하였다. 동시 다중 유전자 증폭기술을 위한 8종 개별 균 주에 대한 특이적인 프라이머를 디자인 하였고, 민감도와 정확성 측면에 있어 최적의 조건을 찾아 적합한 실험조건을 확립하였다. 이러한 방법을 사용하여 국내 주요 식중독 원인 균인 Salmonella typhi, Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Vibrio parahaemolyticus, Staphylococcus aureus 그리고 Escherichia coli O157:H7에 상응하는 개별적인 피크를 얻어 각각을 분리하였으며, 8개 균을 동시적으로 분석해냈다. 이 방법은 식중독을 유발하는 원인물질 조사에 산업적으로 적용되어 식품오염인자의 신속검출방법으로 효과적으로 활용될 수 있으며, 간단한 동시에 민감도 또한 높기에 국가적 사회적 차원에서 식품안전분야의 신뢰성을 제공할 수 있을 것이다.;Conventional detection and identification methods for pathogens are time-consuming and labor intensive due to the necessity of separate cultivation of each target strain. In this study, a parallel analysis method using capillary electrophoresis-based single-strand conformation polymorphism (CE-SSCP) combined with 16S rRNA gene-specific PCR was developed for rapid and effective detection of eight pathogens associated with food poisoning. Specific primers for PCR were designed, and multiplex PCR conditions including annealing temperature, extension time, the number of PCR cycles and primer concentrations were optimized for this simultaneous detection of all target foodborne pathogens with better specificity and sensitivity. Using the developed CE-SSCP coupled with multiplex PCR method, Salmonella typhi, Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Vibrio parahaemolyticus, Staphylococcus aureus and Escherichia coli O157:H7 were simultaneously identified with individual corresponding peaks in a mixture of their genomic DNA. This method can be used for rapid investigation of causative agents of food poisoning and its simplicity and high sensitivity may lead to improved management of food safety.