면역 분석법에 의한 씨앗류의 amygdalin 정량

Abstract

아미그달린(amygdalin)은 시안배당체(cyanogenic glycoside comp -ound) 물질로 보통 과일의 씨앗이나 견과류 그리고 몇몇 식물에 존재한다. Emulsin에 의해 benzaldehyde, cyanide, 그리고 두 분자의 포도당으로 분해되는데, 여기서 cyanide는 신경독성 물질로 메스꺼움, 구토, 두통, cyanosis의 원인이 되며 심하면 죽음에 이르게 되므로 위험하다. 기존의 amygdalin분석은 주로 HPLC를 이용하여 정량하였으나 분석시간이 길고, 장비가 고가이며 특별한 분석기술을 요한다. 때문에 amygdalin을 정량하기 위한 빠르고 정확한 분석방법의 개발이 필요하다. 이 실험의 목표는 amygdalin에 특이적으로 반응하는 항체를 개발하여 이를 이용한 indirect competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA) 분석방법을 확립하고 씨앗 내에 amygdalin을 정량하는 것이다. Amygdalin은 분자량이 457 Da으로, 5 kDa이하의 작은 분자들은 스스로 항체의 생산을 유도하지 못하기 때문에 KLH와 conjugation한 상태로 전환하여 항체를 생산하였다. Affinity chromatography를 이용하여 정제한 항체(IgG)를 이용하여 amygdalin 표준물질과 코팅된 항원 간에 경쟁적인 반응을 관찰한 결과, 코팅된 항원과 결합할수록 발색이 더 진해짐을 확인할 수 있었다. 이 원리를 바탕으로 indirect competitive ELISA를 이용하여 회수율을 확인한 결과 Soxhlet, PVDF, Mixed SPE cartridge 그룹의 회수율이 각각 121.3 ±14.2, 115.8±7.65 %, 108.56 ± 2.50 %로 다른 방법으로 전처리한 그룹에 비해 회수율이 높았다. Amygdalin 표준물질을 이용한 실험에서 검출한계는 5 ng/ml, 정량범위는 40 ~ 80 ng/ml로 HPLC의 검출한계 200 ng/ml 보다 약 40배가량 민감도가 높았다. Soxhlet 추출기로 추출한 액을 바로 정량할 경우 정확도가 HPLC에 비해 떨어졌지만 이를 원심분리한 후 중간층액을 취해 시료로 한 Soxhlet 그룹과 PVDF, mixed SPE cartridge Group 간의 결과를 비교해보았을 때 큰 차이가 없음을 확인 할 수 있다. 이는 PVDF나 mixed SPE cartridge와 같은 filtration없이 Soxhlet 추출 후 4 ℃에서 9000 rpm으로 15분간 원심분리한 중간층(수용액층)을 취하여 정량하여도 amygdalin 정량이 가능함을 나타낸다. 본 연구는 면역분석법을 이용하여 amygdalin을 정량한 최초의 분석결과로, 기존의 분석방법보다 민감도가 높으며 쉽고 빠르고 정확하게 씨앗 내 amygdalin을 정량할 수 있음을 확인하였다.;Amygdalin is a cyanogenic glycoside compound commonly found in the pits of many fruits, raw nuts and other plants. Cyanide reversibly inhibits cellular oxidizing enzymes which contain ferric iron such as cytochrome oxidase and induces the uncoupling of oxidative phosphorylation. High performance liquid chromatography (HPLC) has been used to quantify amygdalin in sample, but it takes long time and needs expertise. Therefore, it needs to develop a rapid analytical method to quantify amygdalin. The objective of this study is to produce antibody against amygdalin after immunization and develop Indirect competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) to quantify amygdalin in seeds. Sensitivity to detect amygdalin using ELISA was compared to that using HPLC method. Hapten for amygdalin was synthesized and New Zealand White rabbits with Amygdalin-KLH conjugate were immunized. Sera reactive to amygdalin were successfully raised. Using affinity chromatography which packed protein A-conjugated bead, purified serum immunoglobulin G(IgG). Purified specific antibody reacts to coated antigen and amygdalin standard solution competitively. The more specific antibody reacts coated antigen, the stronger chromogenic reaction is developed. Specific antibody against amygdalin was produced. Using this antibody, amygdalin 5 ng/ml was detected and quantified from 40 ng/ml to 80 ng/ml, whilst detection limit of HPLC method was 200ppb. This value is 40 times more sensitive than that using HPLC method. This is the first time to detect amygdalin using indirect competitive ELISA. This ELISA technique saves time to detect amygdalin without special technique.