Pepsin과 chymotrypsin에 의한 대두단백질 11S globulin 가수분해물 및 가수분해 fragment의 allergenicity

Abstract

Soy bean is one of the most common food materials to cause food hypersensitivity reaction. In this study, we have investigated the effect of peptic and chymotryptic hydrolysis of 11S globulins on the allergenicity, the major allergen of soybean. We have tried to identify enzyme hydrolyzed fragments of 11S globulin. In 11S globulin there are acidic and basic polypeptides of the glycinin(G1, G2, G3, G4, G5). The acidic polypeptide(Mw=37-42kDa) is possibly linked by a disulfide bond to a specific basic polypeptide(Mw=17-20kDa). Acidic polypeptide (Mw=37-42kDa) of the glycinin was effectively hydrolyzed, while basic polypeptide(Mw=17-20kDa) was resistant to the hydrolysis with pepsin and chymotrypsin. It may be due to the greater hydrophobic characteristics and compactness of the basic polypeptide. The peptides of ～20kDa molecular weights were obtained through peptic hydrolysis and following chymotryptic hydrolysis of 11S globulin extracts. Hydrolysate of 11S globulin by peptic and chymotryptic hydrolysis was fractionated using gel filtration (Sephacryl S-100). ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) using sera from 6 soybean-allergenic patients showed that allergenicity of 11S globulins was less than 7S globulins. Allergenicity of 11S globulin was reduced by peptic and chymotryptic hydrolysis. Allergenicity of 7S globulin was reduced by peptic hydrolysis. However, allergenicity of peptic and chymotryptic hydrolysis of 7S globulin was increased on two patients and the other patients were reduced. It was probably due to individual difference of IgE epitopes. Hydrolysate of 11S globulin was fractionated using sephacryl S-100 and the nine fractions were obtained. One fraction(Mw=20kDa.) showed the high reactivity with sera of the soybean-allergenic patients. The hydrolyzed fragments of the lower molecular weights didn't show reactivity with patient's sera. Hydrolyzed 20kDa fragments remained on SDS-PAGE, after peptic and chymotryptic hydrolysis of 11S globulin, is considered as G2 basic polypeptide.;식품의 allergenicity는 열처리, 산처리 및 가수분해 등과 같은 가공 방법에 따라 영향을 받을 뿐만 아니라, 위장관계의 소화 효소 및 pH 등에 따라 또 다른 영향을 받게 된다. 특히 위장관계에서의 pH 변화와 소화 효소에 따른 알레르겐의 구조적 변성 및 IgE binding epitopes의 변화 등은 allergenicity에 중요한 결정 요소가 된다. 이에 본 연구에서는 대두단백질의 중요 알레르겐인 11S globulin을 분리하여 위장관계의 주요 단백질 소화효소인 pepsin과 chymotrypsin 처리에 따른 allergenicity의 영향을 살피고, 가수 분해된 11S globulin의 fragments에서 알레르겐으로 작용하는 가수분해 fragments를 확인하였다. Pepsin과 chymotrypsin에 의한 11S globulin의 가수분해 결과, 최종적으로 약 13%의 가수분해도를 나타냈다. Pepsin과 chymotrypsin 모두 반응 시작 후 15분 내에 급속도로 가수분해 되었으며 30분 이후에는 충분히 가수분해 되어 거의 일정한 가수분해도를 나타내었다. 가수분해 peptide의 전기 영동 확인 결과 11S의 acidic polypeptide는 pepsin에 의해서 완전히 가수분해 되어 약 23kDa의 새로운 peptide가 확인 되었으며, basic polypeptide는 그대로 유지되었다. Pepsin 처리 후 chymotrypsin 처리 결과, 23kDa의 fragments는 사라졌으며 basic polypeptide는 부분적으로 가수분해 되어 최종적으로 20kDa의 fragments와 그 이하의 분자량을 갖는 fragments가 확인되었다. 6명의 대두 알레르기 환아 혈청과 1명의 정상 혈청을 이용하여 ELISA로 확인한 allergenicity는 11S globulin이 7S globulin에 비해 다소 낮게 나타났으며, 11S globulin의 pepsin 및 chymotrypsin 가수 분해 후 allergenicity의 감소를 확인할 수 있었다. 이는 효소 가수분해에 의해 11S globulin의 IgE epitope가 잘려지거나 conformation의 변화가 생긴 것으로 사료된다. Pepsin과 chymotrypsin에 의한 가수 분해물은 gel filtration(Sephacryl S-100)을 이용하여 size에 따라 9개의 fractions로 분리할 수 있었다. 이 중 약 20kDa의 분자량을 갖는 fragment에서 allergenicity가 확인 되었으며, 이 fraction은 11S에서 알레르겐으로 알려진 G2 glycinin의 basic polypeptide로 사료된다. 또한 약 7-17kDa의 fraction 및 더 작은 크기의 fragment에서는 한 명의 혈청을 제외하고는 allergenicity 반응성이 나타나지 않았다. G2 glycinin의 basic polypeptide는 그 구조적 단단함과 상대적으로 큰 소수성 때문에 pepsin과 chymotrypsin의 가수분해에 대한 영향이 적게 미친것이라 사료되며, 이러한 구조적 특성으로 Expert Protein Analysis System (ExPASy)의 ‘Peptide Cutter’ 프로그램의 이론적 결과와는 다소 차이가 있었다.