A Nanodisc-Based GPCR-G Protein Binding Assay (G-G BA) for Cell-Free Functional Ligand Screening

Abstract

The purpose of this study is to develop and validate a nanodisc (ND)-based, cell-free G protein–coupled receptor (GPCR)–G protein binding assay (G-G BA) that directly measures ligand-induced receptor activation by monitoring GPCR–G protein coupling. Conventional GPCR functional assays primarily rely on downstream second-messenger or β-arrestin readouts, which are affected by signal amplification, receptor reserve, cellular background, and pathway crosstalk, thereby limiting accurate assessment of intrinsic ligand efficacy. In addition, existing cell-free assays using detergent-solubilized receptors often fail to maintain activation-competent conformations. To address these limitations, this study established a biochemical platform in which the bitter taste receptor TAS2R16 is reconstituted into lipid NDs and its ligand-induced coupling to Gα-gustducin is quantified in a fully cell-free environment. Human TAS2R16 was heterologously expressed in Escherichia coli, purified, and reconstituted into dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC) NDs using MSP1E3D1 as a membrane scaffold protein. The resulting TAS2R16–NDs (T2R16–NDs) were characterized by size-exclusion chromatography, dynamic light scattering, SDS–PAGE, and Western blot analysis, confirming uniform particle size and successful incorporation of both receptor and scaffold protein. A tryptophan fluorescence quenching assay demonstrated a dose-dependent decrease in intrinsic fluorescence upon salicin treatment, indicating that TAS2R16 retained its functional responsiveness in the ND environment. For the G-G BA, Cy5.5-labeled T2R16–NDs were pre-incubated with ligands and then applied to Ni–NTA magnetic beads bearing His-tagged Gα-gustducin; ligand-activated receptors were selectively retained and quantified by measuring Cy5.5 fluorescence after elution. Using the β-glucosides salicin, sinigrin, arbutin, and amygdalin as agonists, the G-G BA yielded clear concentration-dependent responses and enabled determination of EC₅₀ values, while the antagonist probenecid produced concentration-dependent inhibition of salicin-induced signals. Comparison with a Fura-2–based calcium influx assay in TAS2R16/Gα16gust44-expressing HEK293T cells showed that the G-G BA reproduced ligand response patterns observed in the cell-based system but exhibited markedly enhanced sensitivity, including a substantially lower EC₅₀ for salicin. These results establish the G-G BA as a structurally faithful, sensitive, and mechanistically informative platform that directly monitors GPCR–G protein coupling, provides quantitative discrimination of agonists and antagonists, and offers a robust basis for future applications in ligand screening and GPCR mechanistic studies.;본 연구의 목적은 리간드 자극에 의해 유도되는 G 단백질 결합을 직접 측정함으로써 G 단백질 연결 수용체(GPCR)의 활성화를 정량적으로 평가할 수 있는 나노디스크 기반 세포 비의존적 GPCR–G 단백질 결합 분석법(G-G BA)을 개발하고 검증하는 것이다. 기존 GPCR 기능 분석은 대부분 세포 내 이차 신호전달물질 또는 β-arrestin 반응을 측정하기 때문에 신호 증폭, 수용체 예비군(receptor reserve), 세포 내 고유 신호 성분, 경로 간 교차작용의 영향을 받아 리간드의 본래 효능을 정확히 파악하기 어렵다. 또한 계면활성제를 사용한 세포-비의존적 분석법은 수용체의 활성화 가능한 구조를 안정적으로 유지하지 못하는 한계가 있다. 본 연구에서는 이러한 제약을 극복하기 위해 쓴맛 수용체인 TAS2R16을 나노디스크에 재구성하고, 리간드 처리 후 활성화된 수용체가 Gα-gustducin과 결합하는 정도를 직접 측정하는 세포 비의존적 분석 플랫폼을 구축하였다. 재조합된 인간 TAS2R16은 Escherichia coli에서 발현 및 정제하였으며, MSP1E3D1을 지질 스캐폴드로 사용하여 dimyristoylphosphatidylcholine(DMPC) 기반 나노디스크에 재구성하였다. 형성된 TAS2R16–나노디스크(T2R16–ND)는 크기배제크로마토그래피, 동적광산란(DLS), SDS–PAGE, Western blot을 통해 균일한 입자 크기와 수용체·스캐폴드 단백질의 성공적 도입을 확인하였다. 또한 트립토판 형광 소광 분석에서 salicin 처리 농도에 따라 내인성 형광이 감소하여, 나노디스크 환경에서 TAS2R16이 기능적 반응성을 유지함을 확인하였다. G-G BA에서는 Cy5.5로 표지된 T2R16–ND를 리간드와 함께 선처리한 뒤, His-tag이 부착된 Gα-gustducin이 고정된 Ni–NTA 자성 비드에 적용하였으며, 활성화된 수용체만이 선택적으로 비드에 결합하였다. 이후 용출액의 Cy5.5 형광을 측정하여 결합된 수용체–G 단백질 복합체의 양을 정량하였다. β-glucoside류인 salicin, sinigrin, arbutin, amygdalin을 활용한 분석에서 G-G BA는 농도 의존적 결합 증가를 보였으며 EC₅₀ 산출이 가능하였다. 또한 TAS2R16 길항제인 probenecid는 salicin 유도 반응을 농도 의존적으로 억제하여 본 분석법이 길항 활성도 정량할 수 있음을 확인하였다. TAS2R16/Gα16gust44를 발현한 HEK293T 세포에서 수행한 Fura-2 칼슘 유입 분석과 비교한 결과, G-G BA는 세포 기반 분석과 유사한 리간드 반응 패턴을 재현하면서도 salicin에 대해 현저히 낮은 EC₅₀ 값을 나타내는 등 더 높은 민감도를 보였다. 이러한 결과는 G-G BA가 GPCR–G 단백질 결합을 직접 측정할 수 있는 구조적으로 충실하고 민감한 분석 플랫폼임을 입증하며, 효능제·부분효능제·길항제를 정량적으로 구별할 수 있는 도구로써 향후 리간드 스크리닝 및 GPCR 기전 연구에 활용될 수 있는 기반을 제공하였다.