Long-term Feeding of Soy Protein Attenuates Choline Deficient-induced Adverse Effects in Wild Type Mice and Prohibitin 1 Deficient Mice Response More Sensitively

Abstract

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), the most common chronic liver disease, is characterized by lipid accumulation in liver, and it can also progress to nonalcoholic steatohepatitis (NASH) through inflammation and fibrosis and develop cirrhosis and liver cancer in severe cases. Although the number of NAFLD patients continues to increase worldwide, the exact cause of NAFLD has not been revealed yet. The methionine-choline deficient (MCD) diet is a dietary induced model for NASH. Furthermore, methionine, which is an essential amino acid, is the first limiting amino acid of soy protein, and methionine deficiency has been suggested to cause hepatocyte damage resulting in NASH. Prohibitin 1 (PHB1) is a protein mainly present in mitochondrial inner membrane and contributes to the stability of mitochondria. Although the role of PHB1 in cancer remains controversial, it has been reported that hepatocellular carcinoma has been discovered in liver-specific Phb1 knockout mice at 8 months of age and PHB1 is closely related to liver diseases. In this regard, the study investigated the mechanism by which methionine deficiency of soy protein and Phb1 deficiency are involved in the pathogenesis of liver diseases. In this study, liver-specific Phb1 heterozygous mice and wild type mice were fed normal diet, choline-deficient diet (CDD), or soy protein diet with no choline (SPD) for 16 weeks. After sacrifice, serum ALT and AST levels were measured. Glutathione (GSH) concentration and histological changes in liver tissue were observed. The expression levels of methionine metabolism-related genes, lipid metabolism-related genes and inflammation-related genes were measured by real-time quantitative PCR (qPCR). At the ALT and the AST levels, the diets and genotypes did not have a significant effect. mRNA expression of Mat1a, Gnmt, Sahh, Ms, and Gss, which are involved in methionine metabolism, was significantly lower in liver-specific Phb1 heterozygous mice fed the SPD compared with wild type mice fed the SPD. In addition, Gclc, Gclm, and Gss were downregulated in liver-specific Phb1 heterozygous mice fed with SPD and normal diet. Also, fat accumulation was observed in the oil red O staining in the mice fed the CDD and SPD compared with normal diet. In H&E staining, hepatocyte injury and lipid accumulation were alleviated in mice fed SPD compared with CDD. It is considered that expression of Scd1, which plays a crucial role in lipid accumulation among other genes related to lipid metabolism, was lowered in the mice the fed SPD than the mice fed the CDD. In addition, the expression of Tnf-α, inflammatory marker, was lowered in wild type mice fed the SPD than CDD. The expression of the anti-inflammatory cytokine Il-10 was increased in the mice fed SPD. Soy protein, which has relatively low methionine content, causes methionine metabolism abnormality when Phb1 is deficient in mice. In addition, SPD lowers fat accumulation-associated genes and regulates inflammation-related genes, thereby alleviating the fatty liver, a typical symptom of CDD. Therefore, further studies are needed on the relationship between Phb1 and methionine metabolism genetically. Furthermore, soy protein was found to be helpful for the alleviation of NAFLD, rather than contributing to the onset of NAFLD. ;가장 흔한 만성 간질환인 비알코올성지방간 (Nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 지방간 축적을 특징으로 하며, 염증 및 섬유화를 통해 비알코올성지방간염 (Nonalcoholic steatohepatitis, NASH)으로 진행 될 수 있고, 심각할 경우 간경화 및 간암으로 발전할 수 있다. 전세계적으로 NAFLD의 환자는 계속해서 늘어나고 있지만, NAFLD의 정확한 발병 원인이 밝혀지지 않았다. Methionine-choline deficient (MCD) diet는 NASH를 일으키는 영양적 모델로 잘 알려져 있다. 또한, 필수 아미노산인 methionine은 soy protein의 제 1 제한 아미노산이며, methionine 결핍은 간세포 손상을 일으켜 NASH에 기여한다고 보고되어 있다. 한편, Prohibitin 1 (PHB1)은 주로 미토콘드리아 내막에 존재하며 미토콘드리아의 안정성에 기여하는 단백질이다. 암에 대한 PHB1의 역할은 논쟁적으로 남아있지만, 간 특이적 Phb1 knockout 생쥐에서 생후 8개월에 hepatocellular carcinoma가 발견된 것으로 보고되어 간질환과 밀접한 관계를 가진다고 할 수 있다. 이에 본 연구에서는 soy protein의 methionine 결핍과, Phb1 결핍이 어떤 기전으로 간질환 발병에 관여하는지 알아보았다. 본 연구에서는 liver-specific Phb1 heterozygous mice (hetero type)와 wild type의 생쥐에게 normal diet, choline-deficient diet(CDD), soy protein diet(SPD)를 16주 동안 먹인 후 생쥐를 희생하였다. 혈청시료로 ALT, AST 수준을 측정하였다. 간 조직으로 Glutathione (GSH) 농도를 측정하고 조직학적 변화를 관찰하였으며, methionine 대사 관련 유전자, 지방 대사 관련 유전자, 염증 관련 유전자의 발현 정도를 real-time quantitative PCR (qPCR)을 이용하여 측정하였다. ALT, AST 수준에서는 식이와 유전형이 큰 영향을 미치지 않았다. Methionine 대사 관련 메커니즘에 관여하는 유전자들 중 Mat1a, Gnmt, Ahcy, Bhmt, Mtr, Gss의 발현이 Soy protein을 먹은 hetero type 생쥐에서 유의하게 낮아졌다. 또한 GSH를 합성하는 유전자인 Gclc, Gclm, Gss의 발현은 normal diet를 먹인 hetero type 생쥐보다 SPD를 먹인 hetero type 생쥐에서 낮았다. 또한 CDD와 SPD를 먹인 생쥐에서 조직학적 변화 중 Oil red O staining에서 지방이 쌓인 것이 관찰되었다. H&E staining에서는 CDD를 먹인 생쥐에 비해 SPD를 먹인 생쥐에서 간세포 손상과 지방 축적 정도가 완화되었다. 이는 지방대사 관련 유전자들 중 지방 축적에 중요한 역할을 하는 Scd1의 발현이 CDD를 먹인 생쥐에 비해 SPD를 먹인 생쥐에서 더 낮아졌기 때문으로 생각된다. 게다가 염증성 마커인 Tnf-α의 발현은 CDD보다 SPD를 먹인 wild type 생쥐에서 더 낮았고, 항염증성 마커인 Il-10의 발현은 SPD를 먹인 생쥐에서 올라갔다. methionine 함량이 상대적으로 부족한 soy protein은 Phb1이 결핍되었을 때, methionine 대사 이상을 유발한다. 또한 SPD가 지방축적 관련 유전자를 낮추고 염증관련 유전자를 조절함으로써 CDD로 인한 대표 증상인 지방간을 완화시켜준다. 따라서 유전적으로 Phb1와 methionine metabolism 사이의 관계에 대하여 추후 연구가 필요하다고 생각된다. 또한 영양적으로 soy protein은 NAFLD의 발병에 기여하기보다 NAFLD의 완화에 도움이 된다는 것을 확인할 수 있었다.