Roles of tRNA fragmentation and RNA splicing factors in metabolic stress response, adipogenesis, and cancer

Abstract

RNA plays critical roles in the central dogma of molecular biology. For proper structure and function of RNA, a series of processing is required. Depending on the RNA type, different processing steps are applied. tRNA undergoes several processing steps including splicing, post-transcriptional modification, and cleavage. Modifications found in tRNA account for more than half of those in the total RNA. Especially, 5-methylcytosine (5mC) is the most studied modification in tRNA. It is established by DNA methyltransferase 2 (DNMT2) and NOP2/Sun RNA Methyltransferase 2 (NSUN2) and removed by Ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 2 (TET2). In addition, tRNA can be cleaved by angiogenin, resulting in tRNA-derived RNA fragments (tRFs). The fragmentation is often generated in response to stress and can be blocked by DNMT2- and NSUN2-mediated 5mC. Messenger RNA (mRNA) also undergoes multiple processing steps, including mRNA capping, polyadenylation, and splicing. Alternative splicing is important for ensuring protein diversity. Most human genes undergo alternative splicing, resulting in production of protein with various functions from one gene. It is regulated by the spliceosome machinery and numerous splicing factors, for examples heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) and DEAD-box helicase 5 (DDX5). RNA processing, including tRNA fragmentation and alternative splicing of pre-mRNA, is pivotal for development as well as physiological and metabolic response. Disruption of the RNA processing has been linked to the dysregulation of cellular processes and the development of various diseases such as obesity and cancer. Therefore, it is important to understand the molecular mechanisms of RNA processing and its regulators. This dissertation included three independent studies, focusing on the role of RNA processing on metabolic regulation, cell differentiation, and cancer: [Study 1_metabolic regulation] Potential small RNA mediators for transgenerational effects of metabolic stress, [Study 2_cell differentiation] Influences on RNA splicing in early adipogenesis by the splice factor DDX5, and [Study 3_cancer] Functional alignment between the oncohistone H3.3-G34W and the splicing factor hnRNPA1L2 in giant cell tumors of bone. In Study 1, we explored the alterations in small RNA profiles in response to diet-induced metabolic stress using RNA sequencing-based analysis. We also sought to understand the mechanism through which dietary stress triggers tRNA fragmentation in the male germline. Our initial observations noted that high-fat diet (HFD) caused alterations in the expression of tRNA-modifying genes, such as NSUN2 and TET2, along with angiogenin in the testis. Despite no significant changes in tRNA methylation, we found that its fragmentation was significantly induced by HFD. Small RNA sequencing revealed that the tRF3s, which are relatively shorter, were significantly elevated in sperm from the HFD group compared to those on control diet (CD). Analyzing the origins of these fragments, we discovered enrichment of tRF5s from tRNA-Leu-CAA and -Trp-CCA, and tRF3s from tRNA-Gln-TTG in the HFD group. Conversely, tRF5s originating from tRNA-Glu-CTC, -Gly-GCC, -His-GTG, and -Val-AAC/CAC were reduced in the HFD group. We found that HFD-induced angiogenin expression in the testis could be reproduced by AMP-activated protein kinase (AMPK) inhibition, but not by Mechanistic target of rapamycin (mTOR) activation, in testicular cell lines. AMPK-inhibited cell lines exhibited induction of four tRFs (including tRF3s from tRNA-Arg-ACG and tRNA-Pro-AGG/CGG/TGG) and repression of two tRFs (including tRF5s from tRNA-Val-AAC/CAC), mirroring the trends observed in the sperm of the HFD group, even though the overall distribution of tRFs differed between sperms and the testicular cell lines. Furthermore, angiogenin-mediated induction of tRFs was further confirmed by Northern blot analysis. Taken together, our findings suggest that HFD-induced metabolic stress stimulates angiogenin expression through AMPK inhibition, resulting in the production of tRFs. Further studies are needed to determine how tRFs carry out transgenerational effect when transmitted to the zygote. In Study 2, we investigated a potential role of DDX5 in adipogenesis and the underlying mechanism using RNA sequencing-based analysis. We found that the Tet2 and Ddx5 gene was highly expressed around 4 hours after adipogenic induction. The Ddx5 gene was a direct target gene of TET2, showing that the Ddx5 gene expression was decreased upon Tet2 knockdown (KD) during early adipogenesis by changing the methylation status of the Ddx5 locus. DDX5 overexpression reversed Tet2 KD-induced suppression of adipogenesis. Total RNA sequencing revealed that Ddx5 KD led to a great number of alternative splicing events, with relatively low numbers of differentially expressed genes. The enrichment of lipid metabolism-related genes were found through alternative splicing analysis, especially as skipped exon events. Therefore, our findings suggest that Ddx5 expression controlled by TET2 regulates adipogenesis through aberrant splicing of genes involved in lipid metabolism at the early stage. Further functional studies are needed to validate the effects of isoforms produced by alternative splicing through Ddx5 KD on adipogenesis. Lastly, in Study 3, we explored the connection between the splicing factor hnRNPA1L2 and the mutated histone H3.3 in the GCTB bone tumor using RNA sequencing-based analysis. GCTB is a tumor entity with one single nonsynonymous, highly recurrent mutation in histone H3.3 leading to glycine 34 substituted for tryptophan (H3.3-G34W). A previous study showed that oncohistone H3.3-G34W binds the trans-acting splicing factor hnRNPA1L2 with high affinity. Based on RNA immunoprecipitation (RIP) and deep sequencing analysis, we found that RNA associated with isogenic H3.3-G34W extensively overlapped with RNA from RIP-sequencing with hnRNPA1L2. This is in line with RNA sequencing analysis of GCTB with H3.3-G34W that displayed elevated exon skipping (SE) events of splicing. The connection between H3.3-G34W and hnRNPA1L2 was further enforced by the finding that SE events significantly carried hnRNPA1L2 motif in the 5’-end of target exons (p < 0.01). The H3.3-G34W were found to recapitulate elevated SE events in isogenic HeLa cells carrying the mutation. A significant proportion of hnRNPA1L2-associated RNAs encode proteins participating in cell cycle regulation, mainly as targets of the E2F transcription factor family. Knockout experiments of hnRNPA1L2 reduced SE events by almost half suggesting a direct connection. E2F and RIP-sequencing candidate genes included AURKA and TFDP1, both subjects of SE events in GCTB from a previous study. Collectively, splicing aberrations in GCTB showed a profound intersection between H3.3-G34W and hnRNPA1L2 and suggests that faithful splicing is a prerequisite for proper cell cycle control. Future studies may further functionally link critical cell cycle regulators with splicing aberrations in cancer and open for therapeutic interventions. Our results from Study 1, 2, and 3 highlight the important effects of RNA processing on regulating fundamental process during cellular process such as differentiation, and how dysregulation might contribute to metabolic diseases and cancer. ;RNA는 핵산의 일종으로 분자생물학의 중심원리인 센트럴 도그마(the central dogma)에 중요한 역할을 한다. RNA가 적절한 구조를 가지고 기능을 하기 위해서는 RNA 중합효소에 의해 만들어진 전사물들이 RNA processing이라 불리는 적절한 전사 후 RNA 처리과정을 거쳐야 하며, 이는 RNA의 종류에 따라 다른 과정들이 필요로 된다. 예를 들어 아미노산을 리보솜으로 운반하며 단백질 생성에 중요한 tRNA의 경우 다양한 스플라이싱과 변형 과정을 거치게 된다. 특히, RNA의 전체 변형의 절반 이상이 tRNA에서 발견될 만큼 tRNA에 다양한 변형이 존재한다. tRNA의 가장 잘 알려진 변형은 5-메틸사이토신이며, 이는 DNMT, NSUN2, 그리고 TET2와 같은 효소들에 의해 조절된다고 알려져 있다. tRNA는 변형 뿐 아니라 안지오제닌 효소에 의한 절단 과정인 tRNA 단편화도 거치게 되며 이를 통해 tRNA 유래 단편 (tRF)이 생성된다. 단백질을 합성할 수 있는 유전정보를 담아 전달하는 mRNA는 전사 후 5’ 캡 첨가, 3’ 폴리아데닐화 꼬리 첨가, 그리고 선택적 스플라이싱 과정을 거친다. 그중 선택적 스플라이싱은 인트론을 제거하고 엑손을 직접적으로 이어 붙이는 과정으로, 이를 통해 한 개의 유전자에서 여러 종류의 단백질을 생성할 수 있어 단백질 다양성을 증가시키는데 중요한 역할을 한다. 이러한 다양한 전사 후 RNA 처리 과정은 발달 과정 뿐 아니라 생리학적 및 대사적 반응에 중요한 역할을 한다. RNA 처리 과정이 제대로 조절되지 않으면 세포 대사조절 장애 및 비만과 암을 포함한 다양한 질병의 발병을 야기할 수 있기에 세포특이적 RNA 처리 과정 분자적 메커니즘을 이해하는 것이 중요하다. 따라서 본 연구에서는 RNA 처리과정의 역할 및 영향을 생식세포에서 대사 스트레스에 의한 반응과 지방세포 분화 및 암의 예시에 초점을 맞추어 조사하였다. 첫째, Study1에서는 RNA 시퀀싱 기반 스크리닝을 통해 대사 스트레스의 부계 전달을 중개할 수 있는 잠재적 분자를 탐색하여 tRNA 유래 단편을 도출하고 그 유도기전을 연구하였다. 먼저, small RNA 시퀀싱 분석을 이용하여 고지방 식이 유도 비만 생쥐 모델의 정자에서 식이로 유도된 대사적 스트레스에 의해 small RNA프로파일링에 변화가 일어났음을 확인하였다. 이러한 변화의 분자적 메커니즘을 이해하고자 tRNA processing에 관련된 유전자들의 발현 변화를 확인해 보았다. 분석 결과, tRNA 사이토신 메틸화와 관련 있는 Nsun2와 Tet2, 그리고 tRNA 절단에 관련 있는 안지오제닌 유전자의 고환 내 발현이 고지방식이에 의해 증가됨을 확인하였다. tRNA 메틸화 유전자들의 발현이 증가했음에도 불구하고 정자 내 tRNA의 메틸화 정도에는 차이가 없었다. 반면 고지방 식이를 통한 안지오제닌 유전자 발현의 증가와 일관성있게, 정자 내 tRNA 단편화가 변화되었음을 확인하였다. 특히 small RNA 시퀀싱을 통해 tRNA 유래 단편들 중 상대적으로 짧은 tRF3의 양이 고지방 식이를 통해 증가함을 알 수 있었다. 고환에서 고지방 식이로 유도된 안지오제닌 유전자의 발현 증가는 mTOR 활성을 변화시켰을 때는 유도되지 않은 반면, AMPK 활성을 억제했을 때 재현되었다. AMPK 억제를 유도한 세포의 small RNA 시퀀싱 분석 결과, 고지방 식이로 유도된 비만 생쥐 정자에서의 결과와 공통적으로 네 개의 tRNA 유래 단편이 증가하였고, 두 개의 tRNA 유래 단편이 감소하였음을 확인하였으며, 이는 노던 블랏으로 다시 한번 검증하였다. 이 결과들을 통해 고지방 식이로 유도된 대사 스트레스가 AMPK 억제를 통해 안지오제닌 유전자의 발현을 유도할 수 있고, 이를 통해 정자내 tRNA 유래 단편의 생성을 유도함을 밝혀 대사 스트레스의 세대전달에 있어 잠재적 중개분자가 될 수 있음을 시사했다. 둘째, Study 2에서는 RNA 시퀀싱 분석을 이용하여 지방세포 분화에서 선택적 스플라이싱의 조절인자인 DDX5의 역할과 메커니즘을 조사하였다. 먼저, TET2가 지방세포분화에 중요한 역할을 한다고 보고한 선행연구에서, Ddx5 유전자가 잠재적 타겟으로 도출되었고, 그 유전자의 프로모터 및 인핸서 영역에 methylcytosine과 hydroxymethylcytosine 변형이 존재함을 확인하여 TET2가 Ddx5의 전사 수준을 조절할 수 있는 가능성을 확인하였다. 지방 분화 과정에서 Tet2와 Ddx5 유전자의 발현 패턴이 지방 분화 초기 마커들과 유사하며, Ddx5 억제의 지방 분화 억제 효과가 지방 분화 초기 시점에만 보였다는 것을 통해 Ddx5는 지방 분화의 초기 시점에 관여함을 보였다. 이는 지방 분화의 초기 시점에서 Tet2에 의한 Ddx5유전자의 메틸화 상태 변화로 Ddx5 유전자 발현이 조절되며, siRNA를 이용하여 Tet2 발현을 감소시켰을 때 유도된 지방 분화 억제가 DDX5를 과발현한 경우 부분적으로나마 극복된 결과를 통해 Ddx5 가 TET2의 직접적인 표적 유전자임을 발견하였다. 이러한 현상의 분자적 메커니즘을 확인하기 위해 진행한 RNA 시퀀싱 기반 분석 결과, Ddx5억제가 지질 대사 관련 유전자들의 발현변화를 유도하였을 뿐 아니라, 특히 선택적 스플라이싱을 변화시켰음을 알 수 있었다. 이러한 결과들을 통해 TET2에 의해 조절되는 Ddx5가 지방 분화의 초기 단계에서 중요한 역할을 하며, 이는 지질 대사에 관여하는 유전자들의 선택적 스플라이싱을 조절함으로써 지방 분화를 조절할 가능성을 시사한다. 셋째, Study 3에서는 RNA 시퀀싱 분석을 통해 거대세포종 세포에서 종양원성 히스톤 H3.3-G34W과 높은 결합력을 보인 선택적 스플라이싱의 조절인자인 hnRNPA1L2의 역할을 조사하였다. 먼저, 거대세포종에서 높은 발생률을 보이는 히스톤 H3.3의 G34W돌연변이와 hnRNPA1L2의 기능적 관련성을 확인하였다. RNA 면역 침전 및 시퀀싱 분석을 통해 hnRNPA1L2와 H3.3-G34W이 많은 유전자에 함께 위치하며 결합 부위가 유의적으로 중첩됨을 밝혔다. 이 결과는 H3.3-G34W 돌연변이를 삽입하였을 때 유도된 선택적 스플라이싱 결과와 일치하며, 특히 가장 많은 빈도수를 보인 엑손 스키핑 (SE)의 경우, 표적 엑손 5’ 말단에 hnRNPA1L2의 모티프가 유의적으로 존재하는 것을 확인하였다. 또한, hnRNPA1L2와 H3.3-G34W 사이의 중첩된 결합은 주로 세포 주기 조절 유전자, 특히 E2F 전사 인자의 표적 유전자에서 주로 발견되었다. 예를 들어, E2F의 표적 유전자인 AURKA와 TFDP1은 H3.3-G34W에 의해 엑손 스키핑이 일어났으며, 해당 유전자에 H3.3-G34W와 hnRNPA1L2의 중첩된 결합을 보였다. 이러한 결과들을 통해 hnRNPA1L2와 H3.3-G34W의 결합으로 발생한 선택적 스플라이싱을 통해 세포 주기가 조절되며 종양 형성에 영향을 미칠 가능성을 확인하였다. 결론적으로, 본 논문에서는 RNA sequencing 분석을 기반으로 한 세 가지 연구를 통해, 대사적 스트레스에 의한 tRNA 유래 절편화의 변화와 이를 유도하는 기전, 지방세포 분화와 종양원성 히스톤 H3.3-G34W를 가진 거대세포종에서 DDX5와 hnRNPA1L2와 같은 스플라이싱 조절인자들의 역할과 세포특이적 스플라이싱 변화를 연구하였다. 따라서, 본 연구의 결과는 전사 후 RNA 처리과정이 대사 반응 및 세포 분화와 같은 생물학적 과정에 중요함을 제시하였고, 전사 후 RNA 처리가 제대로 조절되지 않을 경우 세포 분화의 조절 장애 및 암과 같은 다양한 질병에 기여할 수 있음을 시사한다.