Effect of β-carotene and oxaliplatin on colorectal cancer by regulating apoptosis and cancer stemness

Abstract

본 연구에서는 베타카로틴이 대장암 항암제인 옥살리플라틴과 함께 세포자연사와 세포 주기 조절, 대장암 줄기세포 발현 조절을 통하여 대장암에 미치는 항암효과를 규명하였다. 대장암은 전 세계적으로 흔하게 발생하는 암의 한 종류로 여러 복합적인 요인에 의해 발생하며, 옥살리플라틴 내성은 대장암에서 잘 알려진 부작용이다. 기존 연구에서는 옥살리플라틴 내성을 줄이는 데 효과적인 여러 기능성 물질이 나타났지만 베타카로틴과의 시너지 효과는 아직 연구되지 않았다. 암세포의 작은 집단에 속하는 암줄기세포는 자가복제 및 종양 형성능력을 갖고 있다. 또한 암줄기세포는 방사선치료나 약물치료 등의 암 치료 방법에 저항성을 가지며, 이는 암 재발의 원인이 된다. 대장암이 재발률이 높은 암인 만큼 암줄기세포를 표적으로 하는 치료기전을 규명하는 것이 절실하다. 본 연구에서는 베타카로틴이 옥살리플라틴 내성 대장암 세포주와 인간 대장 오가노이드에 미치는 영향을 조사하였다. 베타 카로틴이 세포와 오가노이드 생존력, 세포 주기, 암줄기세포 마커에 미치는 영향이 조사되었다. JAK/STAT 경로에서 베타카로틴의 조절 역할도 연구되었다. 본 연구는 옥살리플라틴 내성 세포주에서 옥살리플라틴과 베타카로틴 병용 처리 시 인간 대장암 세포주에서 세포자연사와 세포 주기 정지를 유도한다는 것을 보여주었다. 옥살리플라틴, 베타카로틴 병용처리에 의해 세포자연사 마커인 Bcl-2 발현의 증가, Bax 및 Cleaved caspase3의 단백질 발현이 감소함을 확인하였으며, 형광유세포분석 (FACS)을 통해 베타카로틴 병용 처리 시 세포 주기에서 G2/M기 정지가 유도됨을 규명하였다. 베타카로틴 병용 처리는 정상적인 오가노이드에 영향을 미치지 않으면서 암세포와 종양 오가노이드 생존력을 감소시켰으며, 인간 대장암 세포의 암줄기세포 발현을 억제했다. 일반 및 옥살리플라틴 내성 대장암 세포에서 암 줄기세포 마커인 CD133, Sox2, Oct4의 mRNA 및 단백질 발현이 억제됨을 확인하였다. 또한 베타카로틴 병용처리에 따른 대장암 줄기세포의 자가복제능력이 저하됨을 집락 형성 분석법 (clonogenic assay) 및 구 형성 분석법 (sphere formation assay)으로 확인하였다. 더 나아가, 베타카로틴 병용처리는 또한 인간 대장암 세포주에서 JAK1/STAT3 신호 전달 경로와 관련된 마커를 억제할 수 있음을 확인하였다. 본 연구의 결과는 병용처리가 JAK/STAT 경로를 통해 옥살리플라틴 내성을 조절함으로써 대장암에 대한 옥살리플라틴의 항암 효과를 향상시키는 것을 보여주었다. 종합하면, 옥살리플라틴과 베타카로틴 병용 처리는 세포자연사, 세포 주기 조절, 암 줄기세포 조절을 통해 옥살리플라틴의 내성을 줄임으로써 대장암의 예방 및 치료에 긍정적인 효과가 있음을 함의한다. 더불어, 본 연구는 베타카로틴이 대장암 항암제 부작용 예방 및 치료에도 도움이 될 수 있는 여지를 제시하며, 추후 기전연구를 통한 건강기능식품 및 항암제 개발에 이용됨으로써 결정적으로 국민의 질적인 건강 향상을 뜻한다는데 의의가 있다.;In this study, the effect of beta carotene (BC) and oxaliplatin (OXA) on colorectal cancer (CRC) was investigated by regulating apoptosis, cell cycle control, and colon cancer stemness. CRC is a type of cancer that is common around the world and is caused by a number of complex factors. OXA resistance is a well-known main factor to interfere cancer therapy. Previous studies have shown several functional substances effective in reducing OXA resistance, however, the combination effect with BC has not yet been studied. Among cancer cells, CSCs, which belong to a small group, have the ability to replicate themselves and form tumors. In addition, CSCs are resistant to cancer treatments such as radiation therapy or drug therapy, which causes cancer recurrence. Since CRC is a cancer with a high cancer recurrence rate, it is important to identify treatment mechanisms targeting CSCs. To confirm the results of in vitro, human colon organoids was separated from CRC tissues from the CRC patients. The effects of combination of OXA and BC on cell and organoid viability, cell cycle, and CSCs markers were investigated. JAK/STAT pathway related with cancer stemness was also studied. This study showed that the combination of OXA and BC in OXA resistant cell lines induced apoptosis by regulating Bax, cleaved caspase 3, and Bcl-2 and cell cycle arrest in human CRC cell lines. FACS analysis revealed that OXA, BC, or their combination increased cell arrest in G2/M phase. All treatment reduced cell survival in tumor organoid without causing toxicity in normal organoids. It was confirmed that mRNA and protein expression of cancer stem cells (CSCs) markers CD133, Sox2, and Oct4 were suppressed in HCT116 and OXA resistant HCT116 cells. In addition, the self-replication ability of colon CSCs by OXA, BC, or their combination treatment was decreased by analyzing sphere formation assay and clonogenic analysis. Furthermore, it was confirmed that BC could also inhibit markers associated with the JAK/STAT signaling pathway in human CRC cell lines. This study showed that BC improves the anticancer effect of OXA on CRC by regulating OXA resistance. Taken together, the combination treatment of OXA and BC reduced CRC through apoptosis, cell cycle control, and cancer stemness. In addition, this study suggests BC can be effective in preventing and treating CRC drug.