Effects of adenosine derivatives from Cordyceps militaris on ovarian cancer and aging

Abstract

난소는 주기에 따라 난자를 생성하는 생식기관으로 성 호르몬을 생성하는 중추이기도 하다. 따라서 여성의 생식 및 내분비계의 조절을 수행하는 난소의 건강은 여성의 전반적인 건강에도 중요한 역할을 한다. 난소의 노화가 일어나면 난자 수와 기능의 저하에 따른 생식능력이 감소하며 호르몬에도 변화가 생긴다. 노화가 일어남에 따라 난포자극호르몬(FSH)은 증가하고, 항뮬러관호르몬(AMH)은 감소한다고 알려져 있다. 또한 노화의 과정에서 낮은 정도의 지속된 염증 상태를 유지하는 염증노화(inflammaging)가 일어나게 되는데, 이러한 염증노화와 호르몬 불균형이 발생하면 당뇨나 고혈압, 암과 같은 만성질환의 위험을 높인다는 보고들이 있다. 그 중에서도 노화는 난소암 발병의 큰 위험요소로 작용한다고 알려져 있다. 난소암은 발병률의 85~90 %가 폐경 이후에 발생하며, 노화를 비롯하여 출산력, 피임약의 복용 및 가족력의 복합적인 원인으로 발생한다. 난소암의 치료법으로는 수술을 통한 종양제거와 화학요법이 시행되지만, 경미한 증상으로 인한 늦은 진단, 높은 재발률, 약물의 저항성 획득 및 난소기능 저화와 같은 부작용들로 인해 난제들은 여전히 남아있다. 이 문제들을 타계하는 과정에서 예방 및 병용 요법으로 사용가능한 식물유래 파이토케미컬이 관심을 받고 있다. 식물유래 파이토케미컬의 항노화, 항염, 면역기능 조절, 항암 등의 효능이 알려져 있으며, 그 중 동충하초는 오랜 기간 전통의학에서 양용으로 이용되어 왔다. 동충하초는 코디세핀(cordycepin) 이라 불리는 3'-데옥시아데노신(3’-deoxyadenosine)을 비롯하여 N-(2-hydroxyethyl) adenosine과 같은 아데노신 유도체들의 높은 함량을 보인다. 동충하초 추출물과 코디세핀은 항염 및 항암에 대한 효능이 알려진 바 있으나, 난소노화와 난소암에서의 효능이나 분자적 기전은 아직 명확히 밝혀진 바 없다. 따라서 본 연구에서는 동충하초 추출물(CME)과 코디세핀의 난소노화 및 난소암에서의 긍정적인 개선 효과와 그 기전을 분석하기 위해 다음의 가설을 세웠다: 동충하초 추출물과 코디세핀이 난소노화에서는 항염효과를 보이고 난소암에서는 항암효과를 보이며, 아데노신 유도체로써 그 구조적 특성이 그 효과들을 견인할 것이다. 이 가설을 검증하기 위한 세부 연구 목표는 (1) 동충하초 추출물과 코디세핀의 항암효과를 세포모델과 동물모델에서 검증하고, 아데노신과의 구조적 유사성과 항암효과와의 관련성을 규명하는 것과, (2) 비암성, 노화 난소모델에서 코디세핀의 항노화 효과를 규명하는 것이었다. 세부 연구 (1)에서는 먼저 동충하초 추출물과 코디세핀 처리에 의한 세포모델과 동물모델에서의 항암효과와 분자기전을 규명했다. 동충하초 추출물과 코디세핀 처리는 난소암 세포의 사멸을 유도하였으며, LC3B, ATG5, ATG12, 그리고 BECLIN1을 포함하는 자가포식소체 형성(autophagosome formation)에 관여하는 유전자들의 발현을 유의적으로 증가시켰다. 이는 인간 난소암 세포를 포함하는 이종이직 마우스의 난소종양에서 증가한LC3B 단백질 발현과 난소암 세포에서 증가한 자가포식액포 수를 통해서도 확인되었다. 반면 세포자살(apoptosis)관련 유전자나 세포주기조절(cell cycle arrest) 관련 유전자의 발현은 유의적인 변화를 보이지 않았다. 다음으로, 동충하초 추출물과 코디세핀의 항암효과에 있어 아데노신과의 구조적 유사성이 갖는 의미를 분석하기 위해 아데노신 수용체(ADORA)와 아데노신 수송체(ENT1) 억제제를 이용하여 그 기전을 분석하였다. 동충하초 추출물과 코디세핀은 ADORA보다 ENT1을 통해 항암 효과를 보였으며, ENT1 발현과 코디세핀에 대한 민감도는 양의 상관관계를 보였다. 또한, 동충하초 추출물과 코디세핀이 항암 효과를 보이기 위해서는 일인산 형태(CoMP)로 대사되어 작용하였으며, 이는 아데노신 키나제(ADK) 억제제에 의해 항암효과가 상쇄됨을 통해 확인되었다. 이러한 결과는 AMP-활성화 단백질 키나아제(AMPK)에 대한 리간드 도킹 실험 결과와 일치하였다.코디세핀 자체보다 단일 인산화된 형태인CoMP가 AMPK리간드로 알려진 AMP의 AMPK와 수소결합 형태에 더 유사한 결과를 보였다. 즉, ENT1에 의해 세포 내로 수송되는 동충하초 추출물과 코디세핀은 AMPK-mTOR 신호 전달 경로로 유도된 자가포식소체 형성을 통한 세포사멸 효과를 보였다. 세부 연구 (2)에서는 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)로 유도된 햄스터 난소세포(CHO-K1)와 비암성 노화 마우스의 난소에서 코디세핀의 노화관련 개선 현상을 조사했다. 코디세핀에 따른 혈청에서의Tnfα 농도와 난소조직 및 난소세포에서의 Tnfα, Nlrp3, Ccl5 유전자 발현에서 유의적인 차이를 보이지 않았다. 또한 노화가 진행됨에 따라 감소하는 난포의 수와 증가한다고 알려진 FSH의 혈청에서의 농도 역시 변화를 보이지 않았다. 반면, 코디세피는 노화가 진행됨에 따라 감소한다고 알려진 AMH호르몬의 혈청 수준을 유의적으로 증가시켰다. 또한, 코디세핀은 노화가 진행됨에 따라 감소한다고 알려진 PER2 생체시계유전자의 생체주기(circadian rhythm) 진폭을 증가시켰다. 즉, 코디세핀은 염증 및 노화 과정에서 난소의 염증과 노화 지표들에 직접적인 영향을 미치지는 않지만, 몸의 전체적인 노화관련 표현형의 일부 지표에서는 긍정적인 영향을 나타냈다. 결론적으로, 본 연구에서는 동충하초 추출물과 코디세핀의 난소암에서의 ENT1-AMPK-mTOR을 통한 항암 효과를 규명했으며, 비암성 노화 모델에서 코디세핀의 제한적인 항노화 효과를 보고하였다. 하지만 자가포식에 의한 항암효과를 명확히 규명하기 위해서는 자가포식소체 형성 이후 발생하는 자가포식소체(autophagosome)-리소좀(lysosome) 합성단계에서의 동충하초 추출물과 코디세핀의 역할에 대한 추가적인 연구가 필요하며, 비암성 노화 모델에서 장기적인 코디세핀 처리효과 등의 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다.;Ovarian condition is important for women’s overall health because ovaries play an important role in female reproductive and endocrine system. Ovarian aging has been recognized as a systemic and chronic inflammatory process, which is tightly related with ovarian cancer risk. Ovarian cancer is the most lethal gynecological cancers mostly develops after menopause. The well-known risk factors are hormone imbalances along with inflammaging caused by aging. Primary treatment for ovarian cancer involves a combination of surgery and chemotherapy. Despite the advanced ovarian cancer therapies, unsolved issues remain, including side effects of chemotherapy, poor prognosis, and drug resistance. To overcome the difficulties, the use of phytochemicals and their bioactive compounds are suggested as an alternative for combination or supplementary treatments. In addition, some phytochemicals have been reported to delay ovarian aging-related phenotypes in noncancerous ovaries. Cordyceps is one of the widely used herbal remedies in traditional medicine. Cordyceps militaris is rich in adenosine derivatives including N-(2-hydroxyethyl) adenosine and 3’-deoxyadenosine, also called ‘cordycepin’. It has been suggested to possess anticancer and anti-inflammatory properties. However, little is known about its effects on ovarian cancer and aging, and potential molecular mechanisms have yet to be clarified. Therefore, we hypothesized that adenosine derivatives from Cordyceps militaris exert anticancer and anti-inflammatory effects in ovarian cancer and aging, respectively, as a modulator for adenosine function or signaling. This study was designed to explore beneficial effects of Cordyceps militaris extract (CME) and cordycepin against ovarian cancer and aging, and their mechanistic basis. It had two specific aims as followed: (1) To investigate the anticancer effects of CME and cordycepin on ovarian cancer in vitro and in vivo in relevance to their structure similarity to adenosine. and (2) To investigate the effects of cordycepin on aging-related phenotypes in the aged ovarian models. Firstly, in Study I, the anticancer effects of CME and cordycepin on ovarian cancer in vitro and in vivo and their molecular mechanisms were investigated. CME and cordycepin treatment induced cell death by significantly increasing mRNA levels of autophagosome formation-related genes (LC3B, ATG5, ATG12, and BECLIN1), with little changes in apoptotic genes and cell cycle genes. Protein levels of LC3B and the number of autophagic vacuoles were increased upon the treatments in vitro. The increased LC3B expression was also confirmed in vivo by immunohistochemical staining. Next, the structural similarity of cordycepin to adenosine related to the anticancer effects was investigated using inhibitors of adenosine receptors (ADORAs) and equilibrative nucleoside transporter 1 (ENT1). The results revealed that the cytotoxic effects of CME and cordycepin were mediated by ENT1 rather than ADORAs. It was supported by a positive correlation between ENT1 expression and sensitivity to cordycepin. The cytotoxicity of CME and cordycepin was also reversed by adenosine kinase (ADK) inhibitor, indicating that the conversion of adenosine derivatives to their monophosphate form, cordycepin monophosphate (CoMP), was necessary. Docking analysis on AMP-activated protein kinase (AMPK) showed that CoMP was closer to a known ligand, adenosine monophosphate (AMP), than cordycepin per se in the H-bond configuration. Blocking of AMPK attenuated cytotoxicity and autophagic induction of CME and cordycepin. Taken together, the results demonstrated that CME and cordycepin function as adenosine analogue to exert their anticancer effects through induction of cell death in human ovarian cancer cells through ENT1 transport and AMPK-mTOR-mediated autophagic induction. Secondly, Study II was performed to investigate potential effects of cordycepin on noncancerous ovarian tissues of the aged mice and LPS-induced CHO ovarian cells. Serum TNFα level as well as ovarian mRNA expression of Tnfα, Nlrp3, and Ccl5 did not show significant difference upon cordycepin treatment in vivo and in vitro. In addition, the declined number of ovarian follicles and increased serum Follicle-Stimulating Hormone (FSH) level, which are resulted from aging, were not changed upon cordycepin treatment. However, the treatment significantly increased serum Anti-Mullerian Hormone (AMH) level, and recovered circadian rhythm of the PER2 reporter, whose amplitude was lower in aged mice than young mice. The results together suggested that administration of cordycepin had no substantial influence directly on inflammation and aging process of the ovaries, although it might impact on systemic aging-related phenotype. In conclusion, the findings in the Study I and II shed light on the action of CME and cordycepin in ovarian health with cancerous and noncancerous states both in vitro and in vivo. Cordycepin and CME function as adenosine analogue to exert their anticancer effects through ENT1-AMPK-mTOR in human ovarian cancer, while effects of cordycepin on noncancerous aged models seemed to influence systemic aging process rather than ovarian aging if any.