Effect of dietary fat intake on obesity risk and its modulation by circadian clock control

Abstract

The obesity is one of the greatest public health concerns of the century. Its prevalence has nearly tripled since 1975 and continues to increase globally with more than 1.9 billion overweight individuals around the world. Among multiple factors contributing to its prevalence, excessive energy intake, together with low physical activity, is a primary driver. Low-fat diets with restricted total energy have been a main nutritional advice for the treatment and prevention of obesity for several decades. However, since beneficial effects of diets with high proportion of fat and low proportion of carbohydrate on weight control were suggested, effects of fat intake, especially in regard to its proportion among macronutrients and composition according to types of fatty acids, have become a resurgence of interest. Furthermore, physiological factors that determine responses to external stimuli have been discovered to contribute to the risk of obesity; for example, circadian clock control. Circadian rhythm is tightly linked to metabolic regulation in response to external cues such as dietary composition. Thus, disturbance of circadian clock control or individual genetic variations of the core clock genes are associated with metabolic vulnerability. Nevertheless, it has been little explored how dietary fat proportion or composition affects obesity risk depending on circadian clock regulation. Therefore, we conducted the following two studies for this dissertation: [Study 1] Genetic variations of core clock genes and dietary fat-to-carbohydrate (FC) ratio on obesity prevalence in Korean adults, and [Study 2] Dietary butyrate-induced anti-obesity effect, mediated by regulation of circadian clock and gut microbiome. In study 1, we explored the association between the FC ratio and the prevalence of obesity in Korean adult and modulation by genetic variations of circadian core clock. Based on data from KOGES, the subjects were divided into three groups according to macronutrient patterns by the FC ratio. The prevalence of obesity and abdominal obesity increased in the very-low FC group (VLFC) and low FC group (LFC), compared to the optimal FC group (OFC). In addition, the response to obesity risk according to the FC group were depending on circadian genetic variations. In particular, the ARNTL rs9633885 and CRY1 rs11113192 showed significant interactions with FC ratio. In the male LFC, the major allele homozygous genotype of rs11113192 had a greater risk of obesity, while minor allele carriers had no difference in risk. In females, rs9683835 risk of abdominal obesity was increased in VLFC group with minor allele G carriers but not in AA genotype. These findings indicated that the FC ratio was associated with obesity susceptibility, and the associations might be modulated by circadian clock genetic variants. In study 2, we explored the effects of butyrate on diet-induced obesity (DIO) and metabolic phenotypes and investigated if the effects were mediated by circadian clock or changes in gut microbiome. Dietary butyrate supplementation prevented high-fat diet-induced weight gain, despite increased food intake. Microbiome analyzed by 16S rRNA sequencing showed a significant increase of the ratio of Firmicutes and Bacteroidetes in Long-term sodium butyrate supplemented (LSB) group. Comprehensive metabolomics analysis confirmed a significantly increased level of butyric acid in LSB group than HFD group. Among 112 differential metabolites from the metabolomics analysis, branched-chain amino acids and other amino acids were lower and specific fatty acids were higher in LSB group than HFD group. Interestingly, we found significant butyrate-induced changes in muscle gene expression. The circadian core genes, Clock, Arntl, and Per2, were upregulated in LSB group compared to HFD group, accompanied by significantly increased histone H3-pan acetylation and H4-pan acetylation levels. With the increased expression level of butyrate-transporter encoding gene Slc16a1, Ppar gene family and fatty oxidation-related genes including Pgc1a and Ucp2 were significantly upregulated in LSB group. In C2C12 cell model, we also detected transcriptional regulation of butyrate, enhancing mRNA level of core clock genes (Clock and Per2) and clock-controlled genes, in particular Pgc1a, with increased histone acetylation levels at the promoter region of Pgc1a than the control group. Finally, the inter-omics clustering results indicated that butyrate supplementation was highly correlated with serum lipid profiles and HDACi-stimulated upregulation of circadian clock. Moreover, increased Firmicutes upon butyrate supplementation might be correlated lipid profiles, rather than body wight. The findings support that dietary butyrate supplementation showed anti-obesity effects by enhancing histone acetylation and promoted transcription of clock-controlled genes involved in fatty acid oxidation, and the butyrate-driven changes are accompanied by a potential association between microbial and metabolic changes. In conclusion, our results from Study I and II highlight the important effects of dietary fat intake on obesity and its modulation by genetic variations of core clock genes or by butyrate-induced changes in circadian clock, serum metabolites, and gut microbiota. The findings provide new insights into the dietary fat advice previously presented as an obesity therapy.;비만은 전세계적인 문제로 부각되고 있으며, 우리나라에서도 2020년 38.3%의 비만율을 보이며 가파른 증가추세를 보이고 있다. 비만은 제2형 당뇨병, 심장질환, 뇌혈관 질환을 유도하며 사망률을 높이는 것으로 보고되고 있다. 에너지 섭취 증가와 신체적 활동의 감소로 인한 에너지 불균형은 비만의 주된 요인이며 그 외에 여러 요인이 복합적으로 작용 또한 비만을 유도한다. 지방의 섭취는 에너지 섭취를 증가시켜 체중 증가에 주요한 원인으로 고려되어 왔다. 하지만 최근 당섭취 제한과 함께 고지방의 섭취를 기반으로 한 식단들이 비만의 위험율 감소에 미치는 긍정적 영향이 부각되고 있다. 일부 연구에서는 지방의 비율을 낮춘 저지방 식이가 체중감소를 유도한 반면, 지방의 함량을 높이고 탄수화물의 함량을 낮춘 식이가 더 효과적인 체중감량을 보인 연구들도 보고되고 있다. 또한 비만 연구분야의 최신 동향에서 생체시계 조절의 교란과 장내균총의 불균형이 비만의 위험도를 높힌다고 보고하고 있어, 생체시계와 장내균총이 비만의 조절 인자로 새롭게 주목을 받고 있다. 따라서 본 연구에서는 섭취 지방의 비율과 구성이 비만 위험에 미치는 영향이 생체시계 유전자 조절과 관련이 있는지 조사하였다. 첫째, Study 1에서는 한국 성인에서 식이 다량영양소 분포와 비만 위험의 연관성과 생체시계 유전자의 다형성에 의한 조절을 연구하였다. 먼저, 지방/탄수화물 비율 (FC ratio)로 다량영양소 섭취 패턴을 세 그룹으로 분류한 결과 대상자들의 높은 탄수화물 섭취 비율과 낮은 지방 섭취를 확인하였다. 비만의 유병률은 지방섭취가 낮은 VLFC 군과 LFC 군에서 높았으며 위험율은 생체시계 유전자의 단일염기다형성에 따라 조절되었다. 9개의 생체시계 유전자 다형성으로 층화분석을 실시하였을 때, ARNTL 과 CRY1의 유전적 다형성이 FC ratio와 상호작용이 있는 것을 확인하였다. 남성에서 LFC 군의 major allele homozygous 대상자는 참조그룹보다 높은 비만 위험도를 보인 반면, minor allele carrier 대상자는 위험도의 차이를 보이지 않았다. 또한 여성에서 VLFC 군의 G allele carrier 대상자는 복부 비만의 위험율이 증가하였으나 AA 유전형 대상자에서는 위험도가 증가하지 않았다. 이결과는 지방과 탄수화물의 섭취 비율이 비만의 위험도와 연관이 있으며, 이 연관성이 생체시계 유전자 다형성에 의해 조절됨을 의미한다. 둘째, Study 2에서는 고지방 식이 유도 비만 쥐 모델에서 단쇄지방산 뷰티레이트 공급의 항비만 효과를 살펴보고, 이 효과가 생체시계 유전자 조절과 장내균총의 변화와 관련되어 있는지 분석하였다. 분석 결과, 식이를 통한 뷰티레이트 공급은 식이 섭취는 증가를 야기한 반면 고지방 식이로 인한 체중증가를 억제하였다. 뷰티레이트 공급이 장에 미치는 효과를 분석하고자 장내 미생물 분석한 결과 LSB 군에서 Firmicutes와 Bacteroidetes의 비율을 증가시켰다. 혈청 내 대사체의 변화를 분석한 결과, 뷰티레이트 공급은 butyric acid의 증가를 유도함을 확인하였다. 군간 차이 여부를 기반으로 검출된 112개의 대사체 중 가지사슬 아미노산과 여러 아미노산이 LSB 군에서 감소한 반면, 특정 지방산이 LSB 군에서 증가함을 확인하였다. 뷰티레이트의 식이 섭취가 HDAC 저해제로써 조직의 생체시계 유전자 및 하위 유전자에 미치는 영향을 확인하고자 근육의 mRNA 수준과 히스톤 아세틸화 수준을 분석하였다. 그 결과, LSB 군의 근육에서 Clock, Arntl, Per2 유전자의 발현이 증가하였으며 히스톤 H3와 H4의 아세틸 수준이 증가됨을 확인하였다. 또한 butyrate transporter 유전자인 Slc16a1과 Pparγ, Pparδ의 발현이 증가하였으며 지방산 산화 관련 유전자인 Pgc1a와 Ucp2의 발현이 증가하였다. 또한 C2C12 근육세포에 sodium butyrate를 처리하였을 때, 근육 조직의 유전자 발현과 유사하게 Clock과 Per2가 증가하였으며 Pgc1a와 Ucp2의 발현이 증가하였다. 뷰티레이트 처리한 C2C12에서 히스톤 H3와 H4의 아세틸 수준의 증가하였으며, 크로마틴면역 침강법을 통해 Pgc1a과 Clock의 프로모터 부분의 H4 아세틸 수준이 증가한 것을 확인하였다. 마지막으로, 뷰티레이트로 유도된 분자적 변화, 장내 미생물 변화, 대사체 변화와 표현형 변화의 상관성을 살펴보고자 다중오믹스 기반 상관관계 분석을 실시하였다. 그 결과, 뷰티레이트의 공급이 혈청 지방 수준의 변화와 HDAC 저해제로 촉진된 생체시계 유전자 발현 증가가 연관되어 있었으며 Firmicutes의 증가는 체중의 증가보다 지방 수준의 변화와 상관관계가 높은 것으로 나타났다. 이 결과들을 통해 뷰티레이트 섭취가 히스톤 아세틸화와 지방산에 관여하는 생체시계 하위 유전자의 발현을 증가시켜 식이 유도 비만을 방지함을 확인하였고, 이러한 결과는 장내 미생물 변화와 혈청의 대사적 변화와 연관성이 있음을 알 수 있다. 결론적으로, 본 연구에서는 첫 번째, 한국 성인 코호트 데이터를 기반으로 지방/탄수화물 섭취 비율이 가장 높은 대상자들이 낮은 비만 위험도와 관련이 있었으며, 지방 섭취 비율에 따른 비만의 위험도는 생체시계 유전자의 다형성에 의해 조절됨을 밝혔다. 두 번째, 뷰티레이트의 첨가는 생체시계 유전자와 그 표적유전자를 조절하고 장내 미생물에 영향을 미쳐 식이성 비만을 효과적으로 예방하였다. 따라서 본 연구의 결과는 기존에 주로 이용되던 저지방 식사 기준 접근방법에서 벗어나, 비만 예방 및 치료를 위해 지방의 섭취비율 조절이나 뷰티레이트와 같은 특정 지방산 공급을 활용할 가치가 있음을 제시한다. 특히 생체 시계나 장내 미생물과 같은 생리적 조절인자를 변화시킬 수 있는 영양섭취 패턴이나 성분을 활용하는 것에 대한 가능성을 시사한다.