Prohibitin 1 Deficiency Causes Impairment of Lipid Metabolism and the Disruption is Deteriorated by Excessive Palmitic Acids in Hepatocytes

Abstract

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is characterized by the accumulation of lipid in hepatocytes. In spite of the growing number of NAFLD patients with the increased prevalence of obesity, the pathogenesis of NAFLD remains to be fully elucidated. Prohibitin 1 (Phb1) is an evolutionarily conserved protein, which is expressed predominantly on the inner mitochondrial membrane. Several studies have provided evidences that the Phb1 plays a crucial role not only in proliferation of hepatocytes, but also in lipid metabolism in adipocytes. Since the liver is the major site for lipid metabolism, this study was aimed to understand the lipid metabolism regulated by Phb1 in hepatocytes. Normal murine hepatocyte cell line, AML12 was used in this study and Phb1 was disrupted by small interfering RNA (siRNA). These siRNA transfected cells were further treated with saturated fatty acids (SFAs), palmitic acid (PA) for 24 hours. Then the cell viability and the mRNA expression level of key enzymes involved in lipid metabolism were determined. Approximately 20% cell viability decreased when Phb1 was silenced and the cell viability diminished dramatically after PA treatment in both control and Phb1 deficiency groups. Without excessive fatty acids (FAs) inside the cells, Phb1deficiency led to significant mRNA expression level of stearoyl-CoA desaturase-1 (Scd1) to generate triglycerides (TG) and activated the endoplasmic reticulum (ER) stress response by upregulating the mRNA expression level of C/EBP homologous protein (Chop). The elevated expression of peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPARγ), which was reported to be upregulated in the livers of NAFLD patients, was also found in this study. When intracellular FAs were surplus, the catabolism of FAs was inhibited by downregulation of carnitine palmitoyltransferase 1a (Ctp1a), while the synthesis of TG was further promoted by significantly increased mRNA expression level of Scd1. The elevated mRNA expression level of Chop and Pparγ induced by Phb1 disruption were further elevated. Taken together in this study, Phb1 deficiency led to altered lipid metabolism, resulting in the proneness of lipid accumulation inside the cells and ER stress, and these cytotoxic effects were further deteriorated upon the excessive PA treatment.;과도한 지방 섭취로 인해 간 조직에 지방 축적되면 비알코올성지방간 (Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)이 발생하며 지방간 조직에 염증 및 간 섬유화가 진행될 경우 비 알코올 지방간염 (Nonalcoholic steatohepatitis, NASH)이 발전할 수 있으며 나아가서 간경변 및 간암까지 일으킬 수 있다. 비만이 당뇨병 등 성인병에 증가에 따라서 비 알코올성 지방간 환자도 늘어나는 추세에 있다. 그러나 비 알코올성 지방간의 정확한 발병 원인은 아직 밝혀지지 못하였다. Prohibitin 1 (PHB1)은 mitochondrial inner membrane에 존재하는 단백질로 mitochondria의 안정성에 관여한다. 기존 연구결과에 따르면 간 특이적으로 Phb1이 결여된 마우스는 생후 3주부터 간손상이 나타나고 20주 후 간암으로 발전하는 것이 관찰되었다. 이러한 결과를 보았을 때 Phb1의 발현은 간 건강에 큰 역할을 하는 것으로 생각된다. 또한 Phb1은 지방세포에서 세포분열과 지방 대사에 관여한다는 보고가 되어있다. 이에 본 연구에서는 Phb1이 간세포의 지방 대사 및 지방 축적에 관여하는 역할에 대하여 연구를 진행하였다. 본 연구에서는 Phb1 siRNA 사용하여 유전자 Phb1을 knockdown (KD) 시킨 마우스 간세포주인 AML12를 사용하여 saturated fatty acids (FAs)인 palmitic acid (PA) 처리 후 지방 대사에 관련된 유전자 발현 정도를 real-time quantitative PCR (qPCR)을 이용하여 측정하였다. Phb1을 KD한 AML12는 정상 AML12에 비해 PA 처리에 의해 FAs 산화에 조절인자로 알려진 유전자인 Carnitine palmitoyl transferase (Cpt1a)의 mRNA 발현이 유의적으로 감소하였다. Acetyl-CoA carboxylase 2 (Acc2)과 fatty acid synthase (Fasn)는 세포 내 FAs synthesis에 관여하는 enzyme이다. PA를 처리하지 않은 경우, control group과 Phb1을 KD한 group 사이에서 Acc2 mRNA 발현 정도에 차이가 없었고 Fasn mRNA 발현이 감소하였지만, 유의적인 차이는 보이지 않았었다. Phb1을 KD 시킨 후 PA를 처리한 group은 PA만 처리된 group에 비하여 Acc2 및 Fasn mRNA 발현이 유의적으로 감소하였다는 것을 확인할 수 있었다. Stearoyl-CoA desaturase-1 (scd1)는 TG accumulation에 관여하고 Phb1을 KD한 group에서 control group에 비하여 scd1 mRNA 발현 정도가 유의적으로 증가하였고 Phb1을 KD 한 후에 PA를 처리한 세포에는 PA만 처리한 세포보다 mitochondria 내로 FAs의 이동이 감소로 인하여 더 많은 FAs가 cytosol에 축적되어, control에 비하여 scd1의 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여 Phb1의 발현 감소는 세포 내 fat accumulation을 촉진시킬 수 있을 것을 확인할 수 있었다. 마지막으로 lipotoxicity에 의한 ER stress를 알아보기 위하여 DNA C/EBP homologous protein (Chop)의 mRNA 발현 정도를 확인하였다. Phb1을 KD 한 group의 Chop mRNA 발현 정도가 control group에 비하여 유의적으로 증가하였고 Phb1을 KD 시킨 AML12는 PA 처리의 의해 Chop mRNA 발현 정도가 PA만 처리하는 AMl12에 비하여 유의적으로 증가하였다. 이를 통하여 Phb1을 KD한 경우는 PA로 유발된 lipotoxicity로 인한 ER stress가 더욱 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 정리하면 hepatocytes에서 Phb1이 간세포에서 발현이 감소하면, cytosol에 존재하는 FAs의 mitochondria 내로 이동이 감소하며, 이로 인하여 cytosol 내 증가한 FAs는 TG synthesis의 증가로 인해 세포 내 지방이 축적과 더불어 ER stress response로 이어지는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과를 통하여 간 세포에서 지방대사가 Phb1의 발현에 따라 조절될 수 있다는 것을 밝혔으며, 향후 Phb1은 지방 간의 치료 표적으로 사용될 가능성 연구의 기초적인 자료로 이용될 것으로 사료된다.