EHMT2 Inhibitor Induces Cell Death in Human Non-Small Cell Lung Cancer by Altering Cholesterol Biosynthesis Pathway

Abstract

Non-small cell lung cancer (NSCLC) accounts for over 80% of lung cancers diagnosis and epigenetic alteration is one of diverse molecular factors for lung. Epigenetic changes are considered as a hallmark of cancer and a key driver of cancer initiation and progression. Altered expression and activity of epigenetic modifying enzymes change epigenetic landscape in the cell. EHMT2 is a histone methyltransferase encoded by Euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 2 and catalyzes Histone H3 lysine 9 residue (H3K9), resulting in H3K9 mono-methylation (H3K9me1) and di-methylation (H3K9me2). Overexpression of EHMT2 has been reported in cancer including ovarian cancer and NSCLC and the biological consequences of the overexpression have been studied on various aspects of cancer biology, such as amino acid metabolism and metastasis. However, its role in NSCLC was not fully understood. In this study, EHMT2 expression was confirmed to be higher in NSCLC than the normal tissues by using Oncomine. BIX01294 (BIX), a EHMT2 inhibitor, reduced cell viability via autophagy and apoptosis. Through RNA sequencing, we found that BIX altered several pathways related with metabolisms such as cholesterol biosynthesis and ER stress response. BIX directly induced the expression of SREBF2, which is a master regulator of cholesterol biosynthesis, by lowering H3K9me1 and H3K9me2 at the promoter. To confirm that cholesterol biosynthesis pathway was involved in BIX-induced cell death, BIX and a cholesterol biosynthesis inhibitor, 25-hydroxycholesterol (25-HC), were co-treated. It showed that 25-HC recovered BIX-induced cell death by attenuating ATG5-related autophagy. In addition, the expression of ATF4 was directly regulated by BIX and ATF4 transcriptionally regulated its downstream targets, DDIT3 and TRIB3. BIX treatment and ATF4 silencing were combined to find whether ATF4 mediated BIX-induced cell death. We found that ATF4 silencing had no effect on BIX-induced cell death. In summary, EHMT2 was significantly overexpressed in NSCLC and could be inhibited by BIX, inducing cell death via autophagy. Furthermore, BIX directly upregulated SREBF2 expression and its downstream, cholesterol biosynthesis pathway supporting BIX-induced cell death.;비소세포폐암은 폐암 전체의 80%를 차지하고 있고 후성유전적인 변화는 폐암의 위험요인 중 하나로 꼽힌다. 후성유전적 변화는 후성유전적 조절 인자들의 발현 변화나 돌연변이로 인해 발생되며, 암의 주요 특징 중 하나로 여겨지며 암의 발발과 진행에 중요한 인자로 작용한다. EHMT2는 히스톤 메틸전달효소 중 하나로 히스톤 3 라이신 9 (H3K9)에 한 개 혹은 두개의 메틸기를 붙이는 기능을 한다. EHMT2는 여러 암에서 높은 발현을 보이는 것으로 알려져 있고 그 예로 난소암과 비소세포폐암이 속한다. 이렇게 높은 EHMT2 발현은 아미노산 대사와 암의 전이과 같은 다양한 암 생물학에 관련한다는 연구가 진행되고 있다. 그러나, 비소세포폐암에서 EHMT2의 역할은 아직 잘 연구가 되지 않았다. 이 연구에서 EHMT2의 발현 정도를 알아보기 위해 Oncomine의 공개된 데이터베이스를 이용하였고, 그 결과 비소세포폐암에서 과발현되는 것을 밝혔다. 또한 EHMT2의 효소적 활성을 억제하는 BIX01294 (BIX)가 세포자가포식을 통하여 (Autophagy) 세포 증식을 막는 것을 보았다. 세포자가포식 유전자가 BIX의 농도에 따라 유의적으로 증가하며 세포자가포식의 지표로 알려진 LC3B-Ⅱ의 증가 또한 확인하였다. 이후 그 기전을 알아보기 위해 RNA sequencing을 진행하여 BIX가 콜레스테롤 생합성과 같은 대사경로에 관련된 유전자 발현을 변화시킨다는 것을 알았다. BIX가 실제로 콜레스테롤 생합성 조절에 간여하는 지를 확인하기 위해 우리는 콜레스테롤 생합성에서 잘 알려진 유전자들의 발현을 확인하였고, 또한 콜레스테롤 생합성의 조절인자로 알려진 SREBF2의 발현정도를 확인하였다. 그 결과, SREBF2와 콜레스테롤 생합성 관련 유전자들의 발현이 BIX에 의해 유의적으로 증가한 것을 확인하였다. 더구나, ChIP을 통해 SREBF2의 발현이 BIX에 의해 H3K9me1과 H3K9me2가 감소함으로 인해 조절됨을 밝혔다. 이러한 조절이 BIX가 유도한 세포 증식억제에 관여하는 지를 보기 위해 콜레스테롤 생합성의 저해제인 25-HC를 함께 처리하였고, 콜레스테롤 생합성이 BIX가 유도한 세포 증식억제에 관여하며, 이는 ATG5를 통한 세포자가포식을 약화시키는 기전을 통하는 것으로 보여진다. 이를 통해, BIX를 통한 EHMT2의 조절이 콜레스테롤 생합성 경로의 활성을 통해 세포자가포식을 유도함을 밝혔으며, 이는 이후 EHMT2를 이용한 암표적치료의 기초적인 자료로 이용될 것으로 사료된다.