Panax ginseng extract rich in protopanaxatriol enhances nitric oxide production in human endothelial cells by stimulating both PI3K/Akt and AMPK pathways

Abstract

이 연구는 Panax ginseng C.A. Meyer의 주요물질인 Protopanaxatriol계 물질이내피세포 내 NO생성과 관련한 기전 연구를 수행하였다. 인삼은 내피세포에서 NO 생성을 통해 심혈관계에 유익한 영향을 끼치는 것으로 알려져 있다. 문헌조사 결과 인삼의 심혈관계 기능성 실험에서는 단일물질에 초점을 맞춰왔던 것으로 확인되었다. 하지만 최근 몇 년간 최소한의 가공은 식품의 영양적 가치뿐만 아니라 부작용의 문제로 중요시 되어왔기에 우리는 인삼의 단일물질보다 덜 가공된 형태인 Protopanaxatriol계 물질을 선택하여 단일물질과의 기전 차이점을 알고자 하였다. 내피세포에 인삼추출물(GE), Protopanaxatriol계 물질(TF), Protopanaxadiol계 물질 (DF), Rg1, Re (Protopanaxatriol계 물질의 단일물질), Rb1 (Protopanaxadiol계 물질의 단일물질)의 NO 생성량을 DAF-2를 통해 확인한 결과, TF>GE>DF>Rg1의 순서로 유의적인 차이를 나타냈다. 이를 토대로 인삼의 NO 생성은 인삼추출물과 단일물질보다는 TF추출로 섭취할 때 가장 큰 의미를 지녔다. 그 차이점에 대한 이유를 알아보기 위해서 TF와 Rg1을 채택했으며 기전연구를 수행하였다. 기전의 중요한 길목에 위치한 단백질의 antagnonist를 미리처리한 뒤 western blot, RT-PCR 방법을 수행하였다. 각 antagonist는 RU 486 (glucocorticoid receptor antagonist), Fulvestrant (Estrogen receptor antagonist), Wortmannin (PI3K/Akt antagonist), Compound C (AMPK antagonist)그리고 L-NAME (eNOS antagonist) 채택함으로 PI3K/Akt 와 AMPK경로를 이용한다는 가설을 세울 수 있었다. 인삼추출물들은 스테로이드 호르몬과 유사한 형태로, 양친매성 물질이므로 세포막을 자연스럽게 통과할 수 있으며 세포안에서 receptor를 통해 다양한 신호전달을 할 수 있는 것으로 알려져있다. 따라서 기전연구는 non-genomic 과 genomic 적인 측면으로 나누어 생각해보았다. 우선 receptor의 경우 protopanaxatriol계 물질은 주로 glucocorticoid receptor를 이용하고, protopanaxadiol계 물질은 estrogen receptor를 사용하는 것으로 알려져 있었는데 실험결과 TF와 Rg1은 모두 glucocorticoid receptor를 이용하는 것으로 나타났다. 또한 TF는 모든 antagonist에서 eNOS 인산화가 감소된 결과 PI3K/Akt, AMPK 경로를 이용하여 eNOS 인산화를 통해 NO 생성에 관여하는 것으로 나타났으며, 반면에 Rg1은 PI3K/Akt, AMPK 경로 모두를 사용하지 않는 것으로 나타났다. 또한 TF에서 AMPK 경로를 차단하였으나 Akt 인산화가 증가한 것으로 보아 이 둘 경로는 서로 의존적인 성격을 지님을 확인하였다. eNOS 발현정도를 통해 genomic 측면을 확인한 결과 eNOS 발현이 증가되지 않는 것으로 보아 우리가 실험에서 설정한 시간인 10분은 eNOS 발현에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다.;The pharmacological effects of ginsenosides have been suggested to have stimulating nitric oxide (NO) production. Water or ethanol extract minimally processed have been paid attentions as a functional food due to the possible side effect of single chemical as well as the nutritive value. We hypothesized that ginseng fraction prepared by the minimal processes might lead to a higher NO-releasing potency of releasing NO from endothelium than individual ginsenosides. NO production in HUVECs was measured using the fluorescent probe DAF-2 for NO production. Test materials showed significantly high induction of NO compared to vehicle (p<.0001) with the order of TF > GE > DF > Rg1. The maximum capacity was shown by 10 min incubation at the concentration of 150?g/ml. The TF at this concentration level contains 26 ?M as Rg1. We speculated that multiple components present in TF might display the additive effect via the stimulation of more than one signaling pathways. In this study, we focused on the phosphorylation of key proteins in two cellular signaling pathways, PI3k/Akt pathway and AMPK pathway, which are likely to be associated with the phosphorylation and expression of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in response to TF or Rg1. Glucocorticoid receptor (GR) activation is critical for eNOS phosphorylation mediated NO production in HUVECs treated with TF or ginsenoside Rg1. Activation of Akt phosphorylation was observed only in HUVECs treated with TF (p=0.06), but not in those treated with ginsenoside Rg1. And, the data support the conclusion that both PI3K/Akt and AMPK dependently regulates eNOS phophorylation because Compound C (AMPK antagonist) increase the Akt phosphorylation. We dected that TF stimulated AMPK pathway for NO production and Rg1 did not activate for NO production. As a result, TF played an important role on the activations of GR, PI3K/Akt pathway and AMPK pathway to stimulate NO production.