감잎 에탄올 추출물이 위암, 간암 및 대장암 세포주에 미치는 항암효과

Abstract

본 연구는 추출용매(0%, 50%, 75% 에탄올 용매)와 추출온도(80℃, 실온)를 달리한 조건에서 감(Diospyros kaki)잎의 추출물을 준비하여 인간 암세포주(K562 : 백혈구 암세포, SNU16 : 위암세포, Hep3B : 간암세포, SW620 : 대장암세포)에 대한 세포독성효과를 알아보고, 그 중 강한 세포독성효과를 발휘한 감잎추출물을 선정하여 암세포주를 이식한 nude mouse에서의 항암효과와 이들 nude mouse의 면역능에 미치는 영향을 알아보고자 실시되었다. 감잎추출물을 준비한후 이들 추출물의 추출수율과 flavonoids, 비타민 A, C, E의 함량을 측정하였다. 추출용매의 에탄올함량이 높을수록 추출수율과 flavonoids, 비타민 A, 비타민 E의 함량이 높은 경향을 나타내었다. 75% 에탄올 80℃ 추출물이 추출수율과 flavonoids, 비타민 A, E의 함량이 가장 높았으며, 이 추출물의 추출수율은 33.21%였고, 추출물 1g당 flavonoids 함량은 98.34mg이었고, 비타민 A의 함량은 387.87IU였으며, 비타민 E의 함량은 1.6374mg이었다. 비타민 C의 함량은 물 실온 추출물이 가장 높았으며 추출물 1g당 145.75mg이었다. 그리고 MTT(3-〔4,5- dimethythizol-2-yl〕-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, Sigma) assay 방법으로 감잎추출물들의 인간 암세포주(K562, SNU16, Hep3B, SW620)에 대한 세포독성효과를 측정하였다. 그 결과 감잎추출물들은 강한 세포독성효과를 나타내었으며 용매에 따른 차이가 특징적으로 나타나서 75% 에탄올 추출물, 50% 에탄올 추출물, 물추출물의 순서로 나타났다. K562의 경우 모든 감잎추출물이 강한 세포독성효과를 나타내었고, SNU16의 경우 물 80℃ 추출물을 제외한 추출물들이 강한 효과를 나타내었다. 그리고 Hep3B의 경우 75% 에탄올 추출물들이 강한 효과를 나타낸 반면, 물추출물들은 효과가 약하게 나타났으며, SW620의 경우 추출용매에 따른 차이가 가장 뚜렷하게 나타나서 75% 에탄올 추출물들이 강한 효과를 나타낸 반면, 물추출물들은 효과가 약하게 나타났으며 특히 물 80℃ 추출물의 효과가 매우 약하게 나타났다. 그리고 감잎추출물들 중 75% 에탄올 80℃ 추출물이 추출수율과 flavonoids, 비타민 A, E의 함량이 가장 높았으며, 모든 암세포주에서 가장 강한 세포독성효과를 발휘하여 암세포주를 이식한 nude mouse에서의 항암효과를 측정하기 위한 시료로 선정하였다. 암세포주(SNU16, Hep3B, SW620)를 이식한 nude mouse에 75% 에탄올 80℃ 추출물을 투여하여 생체내에서의 항암효과와 이들 nude mouse의 면역능에 미치는 효과를 측정하였다. 각 암세포주별로 생후 6주된 암컷 nude mouse(BALB/c)를 25마리씩 구입하여 실험 시작전 1주일간 적응시켰다. 적응기간후 nude mouse들을 5마리씩 5군으로 나누어, 75% 에탄올 80℃ 추출물을 식이의 4%, 8% 수준으로 첨가하고, 75% 에탄올 80℃ 추출물을 1.65mg/100㎕, 3.3mg/100㎕ 농도로 준비하여 IT(intratumoral) injection 방식으로 이틀에 한번씩 주입하고, 암은 이식하되 75% 에탄올 80℃ 추출물을 투여하지 않은 군을 대조군으로 하였다. 그리고 이식 3주후부터 75% 에탄올 80℃ 추출물을 4주간 투여하여 초기 암치료효과를 관찰한 후 희생시켰다. Nude mouse의 종양의 무게와 부피를 측정한 결과 75% 에탄올 80℃ 추출물의 투여가 모든 암세포주에서 종양의 무게와 부피를 유의적으로 낮추어 항암효과를 나타내었다. SNU16을 이식한 nude mouse의 종양의 무게와 부피는 모든 실험군들이 대조군에 비해 유의적으로 낮았고, 식이내 감잎추출물의 함량이 높을수록 종양의 무게와 부피가 감소하였다. Hep3B를 이식한 nude mouse의 종양의 무게는 4% 식이군을 제외한 모든 실험군들이 대조군에 비해 유의적으로 낮았고, 종양의 부피는 모든 실험군들이 대조군에 비해 유의적으로 낮았으며, 식이내 감잎추출물의 함량이 높을수록 종양의 무게와 부피가 감소하였다. 한편 SW620을 이식한 nude mouse의 종양의 무게와 부피는 모든 실험군들이 대조군에 비해 유의적으로 낮았으며, IT 주입농도가 높을수록 종양의 무게와 부피가 감소하였다. 한편 nude mouse의 비장에서 면역세포를 분리한 후 단클론항체를 이용하여 T cell subpopulation(CD4, CD8), natural killer(NK) cell, MHC class II의 분포를 flow cytometry로 immunophenotyping하였다. 그 결과 SNU16을 이식한 nude mouse의 경우 helper T cell(CD4)은 IT 고농도 주입군만이 대조군에 비해 유의적으로 높았으나 cytotoxic T cell(CD8)은 모든 실험군들이 대조군에 비해 유의적으로 높았으며 그 차이의 폭도 컸다. 그래서 helper/cytotoxic T cell ratio(CD4/CD8)는 모든 실험군들이 대조군에 비해 유의적으로 낮았다. 그리고 natural killer cell과 MHC class II의 경우 모든 실험군들이 대조군에 비해 유의적으로 높았다. Hep3B를 이식한 nude mouse의 경우 helper T cell과 cytotoxic T cell에서 모든 실험군들이 대조군에 비해 유의적으로 높았다. 그 결과 helper /cytotoxic T cell ratio는 모든 실험군들이 대조군과 유의적인 차이를 보이지 않았다. 한편 natural killer cell의 경우 모든 실험군들이 대조군에 비해 유의적으로 높았으며, MHC class II의 경우 8% 식이군과 IT 고농도 주입군이 대조군보다 유의적으로 높았다. SW620을 이식한 nude mouse의 경우 helper T cell과 cytotoxic T cell에서 모든 실험군들이 대조군에 비해 유의적으로 높았으나 실험군들과 대조군과의 차이의 폭은 cytotoxic T cell이 더 컸다. 그래서 helper /cytotoxic T cell ratio는 모든 실험군들이 대조군에 비해 유의적으로 낮았다. 한편 natural killer cell은 모든 실험군들이 대조군에 비해 유의적으로 높았고, MHC class II는 모든 실험군들이 대조군에 비해 유의적으로 낮았다. 이상의 결과를 종합해보면 추출용매와 추출온도를 달리한 감잎추출물들은 인간 암세포주(K562, SNU16, Hep3B, SW620)에 대해 세포독성효과를 나타내었다. 특히 용매에 따른 차이가 특징적으로 나타나서 에탄올함량이 높을수록 추출수율과 flavonoids 함량, 비타민 A, 비타민 E의 함량이 높았으며, 항산화물질 함량이 높은 75% 에탄올 80℃ 추출물에서 세포독성효과가 크게 나타났다. 또한 암세포주(SNU16, Hep3B, SW620)를 이식한 nude mouse에서 감잎 75% 에탄올 80℃ 추출물의 투여가 종양의 무게와 부피를 유의적으로 낮추어 항암효과를 나타내었다. 그리고 nude mouse의 비장의 면역세포들을 측정한 결과 모든 암세포주에서 natural killer cell이 대조군에 비해 유의적으로 높았으며, helper T cell과 cytotoxic T cell도 증가하여서 세포성 면역의 증강이 두드러졌다. ; This study was performed to investigate in vitro and in vivo anticancer effect of persimmon leaf(Diospyros kaki) extracts on human cancer cells. In vitro anticancer effects of persimmon leaf extracts(water extract at 80℃ for 3 hours, water extract at room temperature for 48 hours, 50% ethanol extract at 80℃ for 3 hours, 50% ethanol extract at room temperature for 48 hours, 75% ethanol extract at 80℃ for 3 hours, 75% ethanol extract at room temperature for 48 hours) on human cancer cell lines (K562 : leukemia cell, SNU16 : stomach cancer cell, Hep3B : liver cancer cell, SW620 : colon cancer cell) were investigated by MTT assay. Persimmon leaf extracts exhibited strong in vitro anticancer effects. The higher were ethanol contents, the stronger were in vitro anticancer effects. Extraction yields, contents of flavonoids, vitamin A, C, E were measured. The higher were ethanol contents, the higher were the extraction yields, the contents of flavonoids, vitamin A, E. Among persimmon leaf extracts, 75% ethanol 80℃ extract showed the highest extraction yield, the highest contents of flavonoids, vitamin A, E and exhibited the strongest in vitro anticancer effect on human cancer cell lines. Therefore 75% ethanol 80℃ extract was chosen as material for in vivo anticancer effect investigation. In vivo anticancer effect of persimmon leaf 75% ethanol 80℃ extract was investigated in human cancer(SNU16, Hep3B, SW620) transplanted nude mice. Twenty five female nude mice(BALB/c) were blocked into five groups according to body weight and raised for 4 weeks with diets containing 4%(w/w), 8%(w/w) persimmon leaf 75% ethanol 80℃ extract, with IT(intratumoral) injection treatment with 1.65mg/100㎕, 3.3mg/100㎕ concentration 3 weeks after each human cancer transplanted. Persimmon 75% ethanol 80℃ extract lowered tumor weight and tumor volume significantly in human cancer(SNU16, Hep3B, SW620) transplanted nude mice. Tumor weight and tumor volume of all experimental groups were lower significantly than those of control group in SNU16 transplanted nude mice. Tumor weight of all experimental groups except 4% persimmon leaf extract diet group was lower significantly and tumor volume of all experimental groups was lower significantly than those of control group in Hep3B transplanted nude mice. Tumor weight and tumor volume of all experimental groups were lower significantly than those of control group in SW620 transplanted nude mice. Helper T cell(CD4) of IT injection with 3.3mg/100㎕ concentration group was increased significantly and cytotoxic T cell(CD8) of all experimental groups was increased significantly and helper/cytotoxic T cell ratio of all experimental groups was decreased significantly in SNU16 transplanted nude mice. Natural killer cell and MHC class II molecule of all experimental groups were increased significantly in SNU16 transplanted nude mice. Helper T cell and cytotoxic T cell of all experimental groups were increased significantly and helper/cytotoxic T cell ratio of all experimental groups was not significantly different from control group in Hep3B transplanted nude mice. Natural killer cell of all experimental groups and MHC class II molecule of 8% persimmon leaf extract diet group and IT injection with 3.3mg/100㎕ concentration group were increased significantly in Hep3B transplanted nude mice. Helper T cell and cytotoxic T cell of all experimental groups were increased significantly and helper/cytotoxic T cell ratio of all experimental groups was decreased significantly in SW620 transplanted nude mice. Natural killer cell of all experimental groups was increased significantly but MHC class II molecule of all experimental groups was decreased signific antly. In conclusion, persimmon leaf extracts exhibited strong in vitro anticancer effects on human cancer cell lines(K562, SNU16, Hep3B, SW620). And persimmon leaf 75% ethanol 80℃ extract exhibited strong in vivo anticancer effects in human cancer(SNU16, Hep3B, SW620) transplanted nude mice. Persimmon leaf 75% ethanol 80℃ extract lowered tumor weight and tumor volume significantly and increased natural killer cell, helper T cell and cytotoxic T cell of experimental groups significantly in human cancer(SNU16, Hep3B, SW620) trans planted nude mice.