Chitosan가수분해물의 분자량별 항암 및 면역 증진 활성

Abstract

This study was performed to investigate the average molecular weight range of chitosan hydrolysates showing anticarcinogenic and immunopotentiating effects. The results are summarized as follows: 1. Six fractions of chitosan hydrolysates(MWCO: <1,000 CH-1, 1,000∼3,000 CH-2, 3,000∼10,000 CH-3, 10,000∼30,000 CH-4, 30,000∼100,000 CH-5, >100,000 CH-6)were obtained by acid hydrolysis and ultrafiltration. Degree of deacetylation by IR spectral analysis of each fraction was 69∼80%. Measurement of average molecular weight of each fraction by GPC was nearly the same as the result of ultrafiltration method. 2. Chitosan hydrolysates showed antimutagenic effect of 0∼78% on Trp-P-2, 0∼92% on aflatoxin B_1 and 0∼51% on 2-nitrofluorene in Salmonella typhimuriam reversion assay. Inhibitory effect in Salmonella typhimurium reversion assay showed the highest at 5% concentration of CH-6 on Trp-P-2, 10% concentration of CH-5 on aflatoxin B1 and 5% concentration of CH-6 on 2-nitrofluorene. In SOS chromotest, inhibitory effect on direct SOS function induced by Trp-P-2 showed the highest at 10% concentration of CH-6 and that on direct SOS function induced by 4-NQO showed the highest at 1% concentration of CH-5. The mode of antimutagenic action of chitosan hydrolysates(CH-5 and CH-6) was observed as bio-antimutagenic rather than desmutagenic action in inhibitory effect on the mutagenicity of Trp-P-2. Chitosan hydrolysates had no adsorption ability on mutagens, Trp-P-1 and Trp-P-2, but intact chitosan had strong adsorption ability of 84% on Trp-P-1 and 80% on Trp-P-2 at 3% concentration of intact chitosan. 3. Nitrite production by continuous macrophage cell line J774A.1 was the highest at 2 ㎍/assay concentration of intact chitosan. Hydrogen peroxide production J774A.1 showed the high value of 894μM/mg macrophage protein at 200 ㎍/assay concentration of CH-5 and also the high value 1044 μM/mg macrophage protein at 20 ㎍/assay concentration of CH-6. CH-4, CH-6 and intact chitosan enhanced IL-1 production, while the others did not. TNF production showed the high value at 200 ㎍/assay concentration of CH-4, 20 ㎍/assay concentration of CH-5, 20 ㎍/assay concentration of CH-6 and 2 ㎍/assay concentration of intact chitosan. 4. Spleen weight per g body weight of CH-6 group in the sarcoma 180-bearing mice showed significantly higher value than that of Control group(p<0.05). IL-1 production by peritoneal macrophage cells from tumor-bearing mouse BALB/c mouse was not significantly different among groups But, TNF production showed significantly higher value in CH-6 group than the Control group(p<0.01). 5. IL-2 production by splenocytes from tumor-bearing mice showed significantly higher value in chitosan group than other gruops(p<0.01). Spleen cells to which Con A was added brought about significantly the highest IL-2 production in Chitosan group and C-Lentinan, C-CH-5 and C-CH-6 groups showed significantly high level of IL-2 production. When splenocytes were stimulated with Con A, PHA and LPS, mitogenesis expressed as stimulation index showed that Lentinan, COS-6, CH-5, CH-6 and Chitosan group was significantly higher than another group at 1.5 ㎍/ml and 3.0 ㎍/ml concentration of Con A. Stimulation index of Lentinan group was significantly higher than other groups at 1.5 and 3.0 ㎍/ml concentration of PHA and stimulation index of CH-5, CH-6, Chitosan groups were significantly higher than other groups at 1.5 ㎍/ml concentration of LPS. 6. In vitro cytotoxic effect of chitosan hydrolysate on the growth of Sarcoma 180 cell by MTT assay was not different among tested fractions. But, survival rate of L1210 cell to which chitosan hydrolysates were treated showed 60∼115% and that of U-937, SNU-1, SNU-182 and SNU-C4 showed 41∼109%, 8∼116%, 14∼111% and 7∼115%, respectively. Inhibitory effect of tumor growth of CH-6 group in BALB/c mice was the highest as 91% and that of COS-6 and CH-5 was 84% and 77%. Tumor weight didn t show significantly difference among groups by ANOVA and Student t-test, but show significantly difference in CH-5 and CH-6 groups by Kruskal-Wilcoxon test. In conclusion, chitosan hydrolysates with different average molecular weight had antimugenic effect measured by Salmonella typhimuriam reversion assay and SOS chromotest, and macrophage activation effect in vivo and in vitro. They also had antitumor effect in the BALB/c mouse bearing Sarcoma 180 and cytotoxic effect on the growth of cancer cell lines. These results suggest that CH-5 and CH-6 are most effective in physiological function tested in this study and their average molecular weight calculated by GPC analysis as in the range of 40,000∼70,000. Therefore, further studies are required to find the effecct effect of oral intake, to prove toxicological safety test and to confirm antitumor and immunopotentiating effect against various cancer cells. ; 본 연구에서는 게껍질 급원의 intact chitosan을 산가수분해 및 한외여과법으로 제조한 chitosan 가수분해물의 분자량에 따른 항암 및 면역 증진 활성을 알아보았다. 항돌연변이 활성은 세균을 이용한 Salmonella typhimurium reversion assay 및 SOS chromotest를 이용하여 측정하였다. 면역 증진 활성은 먼저 in vitro법으로 거식세포를 이용한 반응성 질소종, 반응성 산소종 및 cytokines 분비능을 측정하였으며 다음에는 종양 유발 후 BALB/c mice의 복강 거식세포 및 비장세포를 분리하여 활성 증진능 및 세포 증식능을 측정하였다. 항암활성으로는 암세포 치사활성을 in vitro에서 측정한 후, BALB/c mouse를 이용한 종양 성장 억제 활성을 관찰하였다. 1. 한외여과법에 의해 chitosan 가수분해물의 6가지 분획(분자량 범위에 따라 chitosan hydrolysate fraction 1(CH-1) : 1,000 이하, chitosan hydrolysate fraction 2(CH-2) : 1,000∼3,000, chitosan hydrolysate fraction 3(CH-3) : 3,000∼10,000, chitosan hydrolysate fraction 4(CH-4) : 10,000∼30,000, chitosan hydrolysate fraction 5(CH-5) : 30,000∼100,000 및 chitosan hydrolysate fraction 6(CH-6) : 100,000 이상)을 얻을 수 있었다. 각 분획의 infrared spectrum 분석에 의해 산출된 탈아세틸화도는 69∼80%였으며, HPLC를 이용하여 측정한 각 분획의 평균분자량은 한외여과법에 의한 결과와 거의 일치됨을 확인할 수 있었다. 2. Salmonella typhimurium reversion assay 결과, chitosan 가수분해물이 3-amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole(Trp-P-2), aflatoxin B_1(AFB_1) 및 2-nitrofluorene(2-NF)의 변이 작용에 대해 억제 활성을 나타냈는데, Trp-P-2는 0∼78%, AFB_1은 0∼92% 및 2-NF는 0∼51%였다. Chitosan 가수분해물 중 최고 활성을 나타낸 것은 Trp-P-2에 대해 CH-6의 5 mg/plate, AFB_1에 대해 CH-5의 5 및 10 mg/plate, 2-NF에 대해 CH-6의 5 mg/plate 농도에서였다. Escherichia coli PQ 37을 이용하여 SOS chromotest를 실시한 결과, Trp-P-2의 변이 작용에 대해 CH-6의 10 mg/plate 농도, 4-nitroquinoline oxide(4-NQO)에 대해 CH-6의 0.5 mg/plate 농도에서 가장 큰 SOS 유도 저해 활성을 보였다. Chitosan 가수분해물의 돌연변이 억제 방식을 CH-5와 CH-6을 이용하여 시험한 결과, Trp-P-2의 변이 작용에 대해 모두 bio-antimutagenic action을 나타냄을 알 수 있었다. Chitosan 가수분해물은 변이원인 Trp-P-1 및 Trp-P-2와의 흡착능이 전혀 없었으나, intact chitosan은 3% 농도에서, Trp-P-1의 경우 84%, Trp-P-2의 경우 80%의 흡착능을 나타냈다. 3. Continuous macrophage cell line(J774A.1)을 이용한 nitrite 생성능을 비교한 결과, CH-2 및 intact chitosan이 최고 35 μM/2x10^5 cells의 nitrite를 분비하였다. Lipopolysaccharide로 활성화된 J774A.1이 생성하는 nitrite 농도는 CH-2의 200 ㎍/assay 농도일 때 최고치를 보였다. 한편, hydrogen peroxide 분비능을 측정한 결과, CH-5의 200 ㎍/assay 농도에서 894 μM/mg macrophage protein 및 CH-6의 20 ㎍/assay 농도에서 1044 μM/mg macrophage protein의 최고 분비능을 나타냈다. 또한 interleukin-1α(IL-1α) 분비능은 CH-4, CH-6 및 intact chitosan에서만 나타났고, tumor necrosis factor(TNF)의 경우도 CH-4, CH-5, CH-6 및 intact chitosan에서 분비능이 컸으며, CH-4의 200 ㎍/assay, CH-5의 20 ㎍/assay, CH-6의 20 ㎍/assay 및 chitosan의 2 ㎍/assay 농도에서 높은 TNF 분비능을 나타냈다. 4. Thioglycollate-elicited BALB/c mice splenocyte의 interleukin-2 분비능은 concanavalin A(Con A)와 CH-5를 처리했을 때 최고치를 보였다. 비장 면역세포 증식능은 Con A를 처리한 경우 1.5 ㎍/ml 농도에서 CH-1 및 intact chitosan을, 3 ㎍/ml 농도에서 CH-6을 첨가했을 때 PBS에 비해 더 높은 stimulation index(SI) 수치를 나타냈다. Phytohaemagglutinin(PHA)을 1.5 ㎍/ml의 농도로 처리했을 때 CH-6, intact chitosan, NAGA를 첨가한 비장 면역 세포의 SI 수치가 높았으며, 3 ㎍/ml 농도로 처리했을 때 CH-1을 제외한 모든 시료가 비장 면역 세포 증식효과를 나타냈다. Lipopolysaccharide(LPS)를 1.5 및 3 ㎍/ml 농도로 처리한 비장 면역 세포 증식효과는 CH-2를 첨가했을때 가장 높은 SI 수치를 나타냈다. 5. 종양이 유발된 BALB/c mice에서 면역 관련 장기의 무게 변화를 살펴본 결과, 비장의 체중 당 무게는 CH-6군이 α=0.05 수준에서 Control군에 비해 유의적으로 큰 수치를 나타냈다. Peritoneal macrophage cell에 의한 IL-1α 분비능은 control군과 비교했을 때 α=0.01 수준에서 유의적 차이를 나타내는 군은 없었으나, TNF 분비능에 있어서는 LPS로 자극한 경우에 CH-6군 및 Chitosan군이 Control군과 비교하여 α=0.01 수준에서 유의적으로 큰 값을 나타냈다. 6. 종양이 유발된 BALB/c mouse로부터 얻은 비장세포를 이용하여 interleukin-2(IL-2) 분비능을 측정한 결과, Chitosan군이 다른 군에 비해 α=0.05 수준에서 유의적으로 큰 수치를 보였다. 또 Con A를 첨가한 C-Chitosan군이 유의적으로 가장 큰 IL-2 분비능을 보였으며 C-Lentinan군, C-CH-5군 및 C-CH-6군도 IL-2 분비능이 유의적으로 큼을 알 수 있었다. 한편, 비장세포에 Con A, PHA, LPS를 첨가했을 때 세포 증식여부를 측정한 결과, Con A를 1.5 및 3.0 ㎍/ml 농도로 첨가시, Lentinan군, COS-6군, CH-5군, CH-6군 및 Chitosan군의 SI 값이 유의적으로 높았으며, PHA 첨가시 1.5 및 3.0 ㎍/ml 농도에서 Lentinan군이 유의적 차이를 보였고, LPS 첨가시 1.5 ㎍/ml 농도에서 CH-5군, CH-6군 및 Chitosan군이 유의적으로 큰 SI값을 나타냈다. 7. [3-4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay를 이용하여 chitosan 가수분해물의 in vitro 암세포 치사활성을 측정한 결과, Sarcoma 180에 대해서는 각 분획간 치사활성의 차이가 거의 없었고, L 1210은 60∼115%, U-937은 41∼109%, SNU-1은 8∼116%, SNU-182는 14∼111% 그리고 SNU-C4는 7∼115%의 생존율을 나타냈다. Sarcoma 180을 접종한 BALB/c mice에 대한 chitosan 가수분해물의 종양 성장 억제 활성은 ANOVA 및 Student t-test 결과, 군 간에 유의적 차이를 나타내지 않았으나, 크루스칼-윌콕슨 검정에 의하면 Control군의 종양 무게에 비해 CH-5군 및 CH-6군이 유의적 차이를 보이며 작은 수치를 나타냈다. 이상을 종합할 때, 평균분자량이 다른 chitosan 가수분해물은 Salmonella typhimurium reversion assay 및 SOS chromotest를 통하여 돌연변이 억제 활성을 나타냈고, 그 작용 방식은 bio-antimutagnicity임을 알 수 있었다. J774A.1 및 BALB/c mice의 복강 거식세포 및 비장세포를 이용한 in vivo 및 in vitro 실험에서 chitosan 가수분해물이 면역 증진 효과를 나타냈음을 알 수 있었으며, 활성을 나타내기 위해서는 일정한 분자량이상의 고분자이어야 가능함을 알 수 있었다. 다양한 암세포를 이용한 in vitro 암세포 치사 활성 시험에서도 효과를 나타냈으나, Sarcoma 180으로 종양을 유발한 BALB/c mice에 대해서 실험군 간에 종양 성장 억제 활성에 유의적 차이를 보이지 않았다. Chitosan 가수분해물의 항암활성은 유전자의 돌연변이를 억제하고 면역능을 증진시키는 복합적인 기전으로 작용하는 것으로 보여지고, CH-5 및 CH-6이 거의 모든 시험계에서 공통적으로 활성을 나타냄을 알 수 있었으며, 이들의 GPC 분석에 의해 산출된 평균 분자량 범위는 40,000∼70,000이었다.