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Fusarium속이 생성하는 T-2 독소의 곡류중 오염현황 및 독성 연구

Title
Fusarium속이 생성하는 T-2 독소의 곡류중 오염현황 및 독성 연구
Authors
전향숙
Issue Date
1993
Department/Major
대학원 식품영양학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Doctor
Abstract
본 연구는 주로 Fusarium속 곰팡이에 의해 생산되는 trichothecene계 곰팡이독중 독성이 강한 T-2 toxin의 오염현황과 몇가지 독성학적 연구를 수행함으로써 쌀을 비롯한 농산물의 오염예방 및 관리를 위한 기초자료를 제공하고자 착수되었다. 먼저 국내 농산물중 T-2 toxin 생성균의 오염현황을 알아보기 위해 영남지방과 경인지방의 몇가지 농산물에서 Fusarium속 곰팡이를 분리하였고 분리된 균의 인공배양 과정에서의 T-2 toxin생성여부를 TLC 및 GC등의 방법으로 실험하였다. 그런 다음 T-2 toxin에 대한 감도높은 분석 방법을 개발하기 위해 T-2 toxin에 항원성을 부여한 후 토끼에서 폴리클론 항체를 생산하여 ELISA법을 확립하였으며 T-2 toxin생성균주의 선별 및 시료에서의 T-2 toxin분석에 적용하였다. 또한 chick embryo및 병아리를 이용하여 조직에서의 T-2 toxin 축적정도를 분석하였고 생산된 항체를 이용한 면역조직화학적 관찰을 통하여 축적부위를 확인하였다. 그 밖에 chick embryo 독성 시험, chick embryo시기 및 부화후 성장시기에 미치는 T-2 toxin의 영향, 변이원성 시험 등 T-2 toxin의 독성학적 영향을 살펴보았다. 여기에서 얻은 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 경인 및 영남지방에서 쌀을 비롯한 486점의 균원 시료로부터 253주의 Fusarium속 곰팡이를 분리하였고(검출율 53%)분리된 균을 인공배양한 다음 TLC법과 GC법으로 확인한 T-2 toxin 생성균주의 오염율은 조사된 시료의 1.2%이었다. 2. T-2 toxin분석에 있어 면역분석법(ELISA)을 적용하고자 T-2 hemiglutarate 유도체를 만든후 BSA와 결합시켜 T-2 toxin에 항원성을 부여하였다. 이를 New Zealand white 암컷 토끼에 투여한 결과 16주에 역가가 높은 항체를 얻었으며, 항체는 HT-2 toxin, T-2 tetraol, deoxynivalenol과도 각각 42%, 78%, 13%의 교차반응을 나타내었다. 생산된 항체를 이용하여 ELISA법을 확립한 결과 최저 검출 수준은 0.1ppb이었다. 3. 확립된 ELISA법에 의해 T-2 toxin생성균주를 확인해 본 결과 GC법 과 상관성(상관계수 = 0.98, p<0.05)이 높았으며, 영남지역에서 수집한 60점의 쌀시료를 ELISA법으로 분석한 결과 23점의 시료가 양성반응을 보여 38%의 오염율을 나타내었다. 또한 쌀 추출물이 ELISA에 간섭반응을 일으키는 것으로 나타나 시료분석시 T-2 toxin에 쌀 추출물을 첨가시킨 후 표준곡선을 작성하여 정량에 사용하였다. 4. 독성연구에 필요한 많은 양의 T-2 toxin을 생산하고자 F.sporotrichioides M-1-1을 액체배지 및 고체배지에 배양한 다음 정제하여 실험에 필요한 toxin을 얻었다. 5. 배양 10일째 chick embryo에 T-2 toxin을 농도별로 주입하고 5일 동안 배양하여 생존율을 조사한 결과 2.5 μg이상(생존율 22%) 주입군에서는 생존이 거의 불가능하였고 농도증가에 따라 용량 의존적으로 사망률이 증가하였다. 6. T-2 toxin의 투여시기가 다름에 따라 혈청, 간 파브리시우스낭의 축적양상을 ELISA법으로 살펴본 결과, chick embryo나 부화후 어느 한 기간만 T-2 toxin에 노출된 실험군(2, 4군)보다 chick embryo와 부화후 양시기에 모두 노출된 실험군(3군)이 비교적 축적량이 많았다. 7. 조직내에서 T-2 toxin축적양상을 살펴보기 위하여 chick embryo와 부화후 양시기에 T-2 toxin을 노출시켰던 3군과 대조군을 대비시켜 면역조직화학적 관찰을 시도한 결과, 20일째 chick embryo(부화전)에서는 간, 소장, 파브리시우스낭에서 축적양상이 뚜렷하게 나타났다. 특히 간에서는 혈관의 주변 세포들에, 파브리시우스낭에서는 소엽조직 사이에, 소장에서는 융모에 특이적으로 T-2 toxin이 축적되었다. 반면, 부화후 4주째 조직에서 는 축적부위를 나타낼 수 없었다. 8. T-2 toxin에 노출된 닭에 있어서 조직의 형태학적인 변화는 병아리가 부화하기 전에는 간 및 소장에서 관찰되었으며, 4주째인 경우 간, 소장 뿐만 아니라 골수에서도 관찰되었다. 9. 전기영동에 의해 분석한 혈청 γ-globulin양은 T-2 toxin노출시기가 다른 실험군별로 유의적이 차이가 나타났다. Concanavalin A및 lipopolysaccaride등과 같은 mitogen자극에 대한 병아리 비장세포의 반응(in vitro)을 알아본 결과 T-2 toxin노출 시기가 다름에 따라 비장세포의 반응에는 차이가 있었으며, 특히 chick embryo와 부화후에도 계속 T-2 toxin에 노출된 구(3군)이 가장 억제되는 경향을 나타내었다. 10. Ames시험방법에 의한 변이원성 시험에서 T-2 toxin자체는 변이원성이 없었으나 flatoxin의 변이원성에 상승효과를 나타내었다. ; This study was carried out to investigate the contamination and toxicity of T-2 toxin which was a strong toxicity among trichothecenes produced by Fusarium fungi, and to provide basic data for regulation and protection from its contamination in rice and other agricultural products. The results are summarized as follows : 1. From 486 samples of rice and agricultural products collected in Youngnam and Kyongin districts, 253 Fusarium spp. were isolated at 53% occurrence. The Fusarium isolates were incubated and T-2 toxin producing fungi were screened by TLC and GC analyses. The result revealed that samples contaminated by T-2 toxin producing fungi was 1.2% of the samples. 2. To apply ELISA method in analysis of T-2 toxin, T-2 hemiglutarate was made and conjugated with bovine serum albumin to enhance the antigenicity of T-2 toxin. T-2HG-BSA conjugate was injected into New Zealand white female rabbits. In 16 weeks antibody with a high activity was produced and showed cross-reactivates of 42%, 78% and 13% to HT-2 toxin, T-2 tetraol and deoxynivalenol, respectively. In applying the established ELISA method using produced antibody, the lowest detection limit was 0.1 ppb. 3. The result of T-2 toxin producing fungi as determined by ELISA method was highly correlated with that of GC method(γ= 0.98, p<0.05). in applying ELISA method on 60 rice samples from Youngnam district, 23 samples showed positive response with 38% contamination ratio. Because rice extracts showed an interference on the ELISA method, rice extract was added to T-2 toxin solution and standard curve was plotted for use in the quantitative analysis. 4. To produce enough quantity of T-2 toxin for toxicity studies, F. sporotrichioides M-1-1 was cultivated using liquid and solid media. as a result of purification, T-2 toxin in crystal form was produced. 5. T-2 toxin with different concentrations was injected into 10 days-old chick embryo, and they were incubated for 5 days. Survival rate was 22% in the group injected with T-2 toxin over 2.5 μg, and it was dose-dependent. 6. The accumulation of T-2 toxin in serum, liver and fabricius bursa was investigated using ELISA method. The experimental group(group 3) exposed to both chick embryo and chick periods showed higher accumulation than the 2, 4 groups exposed to T-2 toxin either chick embryo or chick periods. 7. To investigate the accumulation pattern of T-2 toxin in organs, group 3 exposed to T-2 toxin both chick embryo and chick periods was observed immunohistochemically in comparison with control group. A distinct accumulation pattern in liver, intestine and fabricius bursa was showed in 20 days-old chick embryo. On the other hand, no distinct accumulation in organs after 4 week-old chick was observed. 8. For chicks exposed to T-2 toxin, histopathological change of tissues was observed in liver and intestine before hatching(20days-old chick embryo). In case of 4 weeks-old-chick, histopathological change of tissues was observed in bone marrow as well as liver and intestine. 9. Electrophoretically analyzed serum γ-globulin showed significant difference among experimental groups. The response of spleen cells to mitogen such as concanavalin A and lipopolysaccaride showed differences among experimental groups with different exposure time of T-2 toxin. Especially, experimental group exposed to T-2 toxin both chick embryo and chick periods showed the most inhibition in blastogenesis of spleen cell. 10. Ames test showed no mutagenicity in T-2 toxin itself, but showed a synergistic effect on mutagenicity of aflatoxin B1. The above results imply that Korean rice and other agricultural products were contaminated by T-2 toxin and its producing fungi. The ELISA method established in this study is considered as a desirable method to detect T-2 toxin, even in a minute quantity, for cereals and animal organs. Through experiment using chick embryo and chick, the accumulation of T-2 toxin was confirmed in some organs. It can be concluded that there is possibility of secondary contamination by T-2 toxin in human body. Additionally, considering several toxic effects revealed by chick embryo test, effect on immune function and mutagenicity test, T-2 toxin contamination is a potential hazard to nation’s health. Therefore, a legal regulation is needed to control T-2 toxin and further studies are required to accumulate more date.
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