지방이 섬유아세포와 흰쥐에서 지질과산화물대사와 노화에 미치는 영향

Abstract

This study was performed to investigate the effects of lipid contents on lipid peroxide metabolism and aging in fibroblasts and in rats In cell culture system, skin fibroblasts from neonate rats were cultured in DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medum) containing 10% FBS(fetal bovine serum)and various amounts of lipid contents (Lipids-cholesterol rich, water soluble media supplement, from adult bovine serum), until they lost their proliferation potential. The CPD(cumulative population doublings) were shortened with increasing lipid contents; 28,123 in 10% FBS only media and 13,417, 11,419, 6,189 in 0.1%, 1% and 5% lipid added in to 10% FBS media, respectively. Lipid peroxide concentrations in fibroblasts were Increased with addition of lipid in media. The addition of various kinds of fatty acid in media had a tendency to influence on cellular proliferation and on lipid peroxide production. Cellular proliferation were inhibited by stearic acid, and stimulated by oleic, arachidonic, and eicosapentaenoic acid. Linolenic acid had no effects. Lipid peroxide concentrations in fibroblasts increased in proportion to the contents and unsaturation of fatty acids. In animal study, Sprague-Dawley rats were fed 30% and 6% fat diet for 12 weeks. High fat group showed the lower contents of plasma lipid peroxide and increased the activity of catalase in liver. Food restricition of high fat diet by 50% resulted in decreased lipids and lipid peroxide contents of plasma and of liver, and no effects in the activities of antioxidant enzyme in RBC and liver. To investigate the effect of age on lipid peroxide metabolsm of rats, Sprague-Dawley rats of 1.5, 5, 11, or 18 months old were used. The body weight and plasma lipid and lipid peroxide contents increased up to 11 months of age thereafter decreased. RBC superoxide dismutase was not infuenced by age, but RBC catalase decreased with increasing age. Liver catalase and glutathione peroxidase increased up to 11 months of age and then decreased at 18 months. Lipofuscin contents in heart and testes increased with age, which was related to the increasing contents of peroxide. In summary, the addition of lipid ad fatty acids in cell culture system increased the lipid peroxide production and influenced on cellular proliferation and CPD. The productions of lipid peroxide were related to lipid contents in plasma and tissues in animal study. Lipid peroxide contents and lipofusin also increased with increasing age. Therefore, conclusion could be made that life span is influenced by dietary condition, which causes the increasing the lipid concentrations in animals. The restriction of high fat diet may delay aging with decreasing the contents of lipid and lipid peroxide. The results of this study showed similar tendency to lipid peroxide production between in cell culture system and in animal study. Therefore, it is considered that the cell culture system is useful method in order to investigate the effects of a specific fatty acid or some lipid components on lipid peroxide metabolism and aging.;본 연구는 지방의 섭취가 노화에 미치는 영향을 규명하기 위하여 세포배양실험과 동물실험을 실시하여 지방함량의 변화가 지질과산화물의 생성과 세포의 증식 및 수명에 미치는 영향을 조사하였다. 세포배양실험에서는 신생흰쥐의 피부에서 일차배양(primary culture)한 섬유아세포를 지방함량이 다른 배지내에서 계대배양(subculture)하여 세포의 증식과 수명을 조사하였다. 10% FBS(fetal bovine serum)가 포함된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)배지에 소의 혈청에서 분리한 배지용 지방(Lipids ? cholesterol rich, water soluble media supplement, from adult bovine serum)을 각각 0.1%, 1%, 5% 첨가하여 세포가 더 이상 증식하지 않을 때까지 계대배양하였다. 그 결과 세포의 수명을 나타내는 지표로 사용된 CPD(cumulative population doublings)는 각각 28,123, 13,417, 11,419, 6,189로 비지의 지방함량이 증가할수록 세포의 수명이 짧아지는 결과를 보였다. 배지요 지방을 0.1%와 1% 첨가해준 군은 배지용 지방을 첨가해 주지 않은 군에 비해 증식속도가 빨라져서 지방의 첨가는 섬유아세포의 증식을 자극하는 효과를 나타냈으나 CPD는 감소하여 세포의 수명을 단축시켰다. 배지용 지방을 5% 첨가한 군은 세포내부에 지방구 같은 입자의 생성이 증가했으며 입자의 크기는 세포의 나이가 증가함에 따라 커졌다. 이때 세포의 증식과 수명이 모두 감소하여 지방을 높은 농도로 첨가해주는 것은 섬유아세포의 증식과 수명에 억제인자로 작용한다고 볼 수 있었다. 배지에 첨가해준 지방함량이 증가할수록 지질과산화물의 생성이 증가하여 배지의 지방함량과 지질과산화물의 함량이 세포의 수명에 영향을 준것으로 나타났다. 5%의 FBS을 첨가한 배지에서 배양한 경우에는 CPD가 5,206으로 세포의 수명이 가장 짧고 지질과산화물의 양은 10%의 FBS를 첨가한 배지에서 배양한 군가 비슷한 정도로 생성되었다. 여러가지 지방산이 세포의 증식과 지질과산화물의 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 10% FBS가 포함된 DMEM배지에 stearic acid(18:0), oleic acid(18:1, n-9),linoeic acid(18:2, n-6), linoleic acid(18:3, n-3), arachidonic acid(20:4, n-6), eicosapentaenoic acid (20:5, n-3)를 absolute alcohol에 녹여 5, 10,25,50,100,150mM의 농도로 첨가하여 섬유아세포를 배양하였다. 그 결과 지질과산화물의 양은 지방산의 첨가량과 불포화도에 비례하여 증가했고 특히 arachidonic acid나 eicosapentaenoic acid를 150mM씩 첨가해 주었을 때는 더 많이 증가했다. 지방산의 종류에 따라 세포의 증식에 미치는 영향은 다양하여 stearic acid는 세포의 증식을 억제한 반면 oleic acid, arachidonic acid는 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 동물실험에서는 식이지방의 함량과 식이제한이 지질과산화물 대사에 미치는 영향을 알아보기 위해 이유후의 Sprague-Dawley종 흰쥐를 우지와 옥수수기름을 2:1로 섞은 것을 지방급원으로 하여 30% 고지방식이와 6% 저지방식이로 12주간 사육하였다. 그 결과 고지방식이군은 저지방식이군에 비해 혈장 지질과산화물의 양이 낮고 간 catalase의 활성은 높은 것으로 나타났다. 고지방식이의 섭취를 50%정도 제한하면 자유급식한 군에 비해 혈장과 간에서의 지질함량과 지질과산화물의 양이 낮은 경향이었으나 유의적인 차이는 아니었고 항산화효소의 활성은 차이가 없었다. 1.5개월, 5개월, 11개월, 18개월된 Sprague-Dawley종의 흰쥐를 대상으로 나이에 따른 지질과산화물 대사의 변화를 살펴보면 혈장의 지질함량 및 지질과산화물의 양은 11개월까지는 점차로 증가하다가 그 후에는 감소하는 양상을 보였다. 간의 지방함량과 지질과산화물의 함량은 1.5개월된 쥐에서 가장 높은 경향을 보였다. 항산화효소 중 superoxide dismutase는 나이에 의한 영향을 받지 않았고 RBC catalase는 나이가 증가함에 따라 점차적으로 감소하는 경향을 보였다. 간에서는 catatase와 glutathione peroxidase의 함량이 11개월까지는 증가하다가 그 이후에는 감소되는 경향을 나타냈다. 나이가 증가함에 따라 심장과 고환의 lipofuscin함량이 증가하여 과산화물들이 나이가 증가함에 따라 축적됨을 나타내었다. 종합하면 세포배양 system에서는 배지의 지방함량이 증가하면 지질과 산화물의 양이 증가했으며 섬유아세포의 수명이 짧아졌고 지방산의 첨가량과 불포화도에 비례하여 지질과산화물의 양이 증가하였다. 동물실험에서는 지질과산화물의 양은 혈장과 간의 지질함량과 관계가 있는 것으로 나타났다. 연령이 증가함에 따라 혈장의 지질과산화물의 양과 조직의 lipofuscin의 축적량이 증가하는 경향이므로 혈장과 조직에 지방함량을 높이는 조건은 지질과산화물 및 lipofuscin의 생성을 증가시켜 생체의 노화를 촉진시키는데 일부는 영향을 미칠것으로 생각한다. 또 식이제한은 혈장과 조직의 지질함량을 낮추고 지질과산화물의 생성을 억제하여 노화를 지연시키는데 기여할 수 있다고 생각된다. 세포배양 system과 동물실험에서 과산화물이 세포와 동물의 수명에 비슷한 영향을 주는 것으로 나타났으므로 특정한 지방산이 지질과산화물이나 수명에 미치는 영향을 연구하기 위해서 세포배양 system을 이용할 수 있을 것으로 생각된다.