Antihypertensive Effect of Triol-Enriched Fraction of Korean Ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer) Ethanol Extract in Vitro and in Vivo

Abstract

Panax ginseng has been extensively used as a herbal medicine in Asia and currently occupied an important place among the dietary supplements and functional ingredients for foods. Among several studies, ginseng has beneficial effects on the cardiovascular system. Hypertension is not only very common but is also an important major modifiable risk factor for cardiovascular disease, stroke, and chronic kidney disease. Three concepts considered for the regulation of blood pressure are the hormonal control, neural control, and local control. In this study, 2 mechanisms of blood pressure control-hormonal control and local control-were examined. This study was especially focused on the renin -angiotensin system (RAS), which is one of the most important hormonal control systems for blood pressure regulation, and on nitric oxide (NO) production, which is an important factor for local blood pressure control. The rennin-angiotensin system (RAS) as one of the important hormonal control plays a role in blood pressure regulation and sodium homeostasis. This study was designed to examine the effect of saponin fraction in order to develop functional ingredients for dietary supplements and then compared the inhibition of angiotensin enzyme activities as well as the activities for their nitric oxide production. Protopanaxtriol and protopanaxdiol enriched fraction (Triol Fr and Diol Fr, respectively) were separated according to their aglycon structure. Using those fractions (Triol Fr, Diol Fr, Rg1- and Re-enriched fractions) and ginsenosides (Rg1, Re, Rb1, Rd, Rg3, and compound K [CK]), we screened activities for inhibition of angiotensin converting enzyme (ACE), the key enzyme of the RAS, activity in vitro and stimulation of NO production in the human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) in order to find physiological active fraction. ACE was not affected by the saponin fractions (Triol Fr, Diol Fr, Rg1- and Re-enriched fractions) and ginsenosides (Rg1, Re, Rb1, Rd, Rg3, and CK). Among those fractions and major ginsenosides which were already reported to have NO production activities, only Triol Fr showed NO production activity. It was also dose dependent tendency. The increase of eNOS activity through Triol Fr was also confirmed indirectly by measuring the L-[3H] citrulline formation from L-[3H] arginine. In addition, with this fraction, we confirmed that our fraction, Triol Fr, regulates the phosphorylation of eNOS and Akt by western blot analysis To further confirm the in vitro effect of Triol Fr, the antihypertensive effect of a Triol Fr on systolic blood pressure was examined in spontaneously hypertensive rat (SHR). In animal study, the results revealed that blood pressure-lowering effect induced by Triol Fr on 24 hour blood pressure monitoring reached maximum at 6 hr and slowly recovered after 24 hr to the initial level in Triol Fr. Also, systolic blood pressure was lower in rats treated with Triol Fr after 4 weeks. SHR treated with Triol Fr was significantly increased the phosphorylation of Akt and the eNOS activity. These in vitro and in vivo results indicate that Triol Fr should have an antihypertensive effect due to NO production from endothelial cells via activation of Akt/eNOS. In conclusion, these results suggest that the Triol Fr of Korean Panax ginseng ethanol extract could be used as a functional food with potential therapeutic benefit in treatment of hypertension. Although we confirmed Triol Fr have anti-hypertensive activities in vitro and in vivo, additional human studies should be required to confirm physiological relevance.;본 연구에서는 인삼추출물로부터 얻은 표준화된 인삼분획물들(protopanaxadiol-, protopanaxatriol-, Rg1-, 그리고 Re-강화 분획물)과 ginsenosides 표준품들 (Rb1, Rd, Re, Rg1, Rg3, 그리고 compound K [CK])이 혈압에 미치는 효과와 그 기전을 인체 유래 내피세포를 이용하여 알아보고자 하였다. 또한 nitric oxide (NO) 생성에 영향을 주는 것으로 나타난 시험물질의 공급이 혈압에 미치는 효과를 동물모델을 통하여 확인하였다. 본 연구에서는 인삼분획물의 혈압조절 기능의 기전으로 renin-angiotinsin system (RAS)와 NO생성능 두 기전을 고려하였다. 본 연구에서는 인삼으로부터 분리한 표준화된 인삼분획물들 및 ginsenosides 가 혈압 조절 기능의 기전으로 RAS의 antiotensin-converting enzyme (ACE) 에 영향을 주는지 알아보기 위해 cell-free system에서 ACE inhibition 정도를 알아보았다. 또한 고혈압은 내피세포의 장애로 NO의 유리가 감소하거나, 또는 내피의존성 수축인자인의 합성 또는 유리의 증가와 관련이 있는 것 보고되고 있어, 사람의 탯줄내피세포 (Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)에서 표준화된 인삼 분획물 (protopanaxadiol-, protopanaxatriol-, Rg1-, 그리고 Re-강화 분획물) 및 ginsenosides (Rb1, Rd, Re, Rg1, Rg3, 그리고 compound K)가 NO 발생에 미치는 영향을 알아보았다. 실험 결과, 모든 시험 물질에서 ACE inhibition 효과를 보이지 않았다. 반면 HUVEC에서 NO 생성량에 미치는 영향을 검토한 결과, protopanaxatriol계 강화분획물 (Triol Fr)에서 농도에 따라NO 생성량을 증가시키는 것으로 나타났고, 시료를 처리한 후 30분에 NO 생성량이 최대인 것을 확인하였다. 본 연구에서 Triol Fr 처리는 HUVEC에서 NO 생성량을 증가시키는 것으로 나타났으나, 6종의 ginsenosides표준품 및 protopanaxadiol-강화분획물 단독처리는 NO생성량에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 또한 Triol Fr에서 Re를 강화한 Re-강화 분획물과 Rg1을 강화한 Rg1-강화 분획물에서는 NO 생성능에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 따라서 NO 생성에 ginsenoside의 단독 효과라기 보다는 몇몇 성분의 상승효과로 예상되고, 이에 대한 연구는 추후에 계속 되어야 할 것으로 사료된다. HUVEC 에 Triol Fr을 처리하였을 때 NO 생성량을 증가시키는 것으로 나타났기 때문에 그 기전으로 NO를 생성하는 효소인 endothelial nitric oxide synthase (eNOS)의 발현정도를 western blotting을 통하여 알아보았다. 그 결과 eNOS의 활성형인 phospho-eNOS (p-eNOS)의 발현이 증가되어, p-Ser1177eNOS/eNOS의 비율이 시험시료의 농도가 증가함에 따라 유의적으로 증가되는 것으로 나타났다. 또한 eNOS의 upstream signaling pathway인 Akt 의 활성형인 phospho-Akt 의 발현도 Triol Fr 에 의하여 증가되는 것을 알 수 있었다. 즉, Triol Fr이 Akt/eNOS signaling pathway를 통하여 Akt 의 인산화를 증가시키고, 이는 eNOS 인산화를 자극하여 결국 NO 생성량을 증가시키는데 기여한다고 볼 수 있다. eNOS activity는 L-[3H]arginine에서 NO가 합성되면서 전환되는 L-[3H]citrulline의 양을 간접적으로 측정하는데, HUVEC에 처리한 Triol Fr 농도가 증가할수록 eNOS activity가 증가되는 것으로 나타났다. 즉, HUVEC에 Triol Fr을 처리하였을 때, 혈관확장인자인 NO 생성량이 유의적으로 증가되었는데, 이는 Akt/eNOS 기전의 활성 증가가 기인할 수 있다고 사료된다. In vitro 시험에서 표준화된 Triol Fr이 NO생성을 통하여 혈압을 조절할 수 있다는 가능성을 제시하였다. 따라서 in vivo 시험에서는 표준화된 Triol Fr이 고혈압유발쥐 (spontaneously hypertensive rat, SHR)의 혈압조절에 미치는 효과를 연구하였다. 먼저, 단 회 투여(0, 100mg/kg, 그리고 500mg/kg) 후 24시간 혈압변화모니터링을 수행한 결과, 500mg/kg의 Triol Fr 공급 6시간 후, SHR의 혈압이 최대로 감소되어, vehicle을 공급한 SHR의 혈압에 비하여 유의적으로 감소되었다. 또한 4주 동안 매일 Triol Fr 의 농도를 달리하여 공급한 결과(0, 50, 100, 그리고 500mg/kg), Triol Fr 을 공급한 SHR에서 dose-dependent 하게 혈압이 감소되는 것으로 나타났다. 또한, 고혈압 흰쥐의 대동맥을 적출하여 인산화된 Akt, eNOS의 발현량을 분석한 결과, Triol Fr을 공급한 쥐의 대동맥 phospho-Akt 발현이 유의적으로 증가되는 것으로 나타났고, Triol Fr을 공급한 쥐에서 eNOS activity도 증가되는 것으로 나타났다. 이상의 실험결과에서, 표준화된 Triol Fr은 혈압을 낮추어 고혈압을 개선시킬 가능성이 있는 것으로 나타났는데, 이는 Akt, eNOS의 활성 증가로 인한 NO 생성 증가에 의한 것으로 사료된다. 따라서, Triol Fr 섭취에 따른 혈압 저하 효과는 고혈압 예방 및 혈압조절을 위한 식품소재로서의 가능성을 보여주었다. 그러나 Triol Fr의 혈압 조절에 대한 추가의 Akt/eNOS upstream signaling pathway에 대한 메커니즘이 연구되어야 하며, 더 나아가 사람을 대상으로 한 임상시험도 수행되어야 할 것이다.