Protective effect of anthocyanin-rich bilberry (Vaccinium myrtillus L.) extract against Doxorubicin-induced cardiotoxicity

Abstract

Doxorubicin (Dox) is a potent and broad-spectrum anticancer drug. However, the development of cumulative dose-related cardiotoxicity forms the major limitation of the clinical use of Dox. There is general consensus that the redox cycling of Dox can generate considerable free radicals which are responsible for mediating the various cytotoxicity and cardiomyopathy. Thus, a detoxifying oxidative stress is one of the most well-known strategies to reduce Dox-induced cardiotoxicity. Therefore, it was hypothesized that anthocyanin-rich bilberry extract with high antioxidant potential may reduce Dox-induced cardiotoxicity. To address this hypothesis, a commercially available anthocyanin-rich bilberry extract (BE) was investigated for its protective potential against Dox-induced cardiotoxicity in H9c2 cardiomyocytes and in rats. To further understand the protective effect of anthocyanin-rich BE against Dox-indcued cardiotoxicity in relation to their antioxidant properties, the active componets of BE, anthocyanidins and anthocyanins were investigated for protective potential against Dox-induced cardiotoxicity in H9c2 cardiomyocytes, and their radical scavening activities. The addition of BE to H9c2 cardiomyocytes damaged by Dox significantly reduced intracellular ROS, restored mitochondrial transmembrane potential, inhibited caspase-3 activity, activated GSTs and eventually, reduced apoptosis and cell death without interfering with the chemosensitivity of Dox. cDNA microarray data showed that BE might decrease the cardiomyocytes apoptosis via modulation of the mitochondrial apoptosis regulators including Bid, Bad and Mcl1. Aglycones, anthocyanidins significantly reduced Dox-induced cardiotoxicity, intracellular ROS and lipid peroxidation in H9c2 cardiomyocyte. In addition, anthocyanidin and anthocyanin did not interfere with chemotherapeutic action of Dox. Even though all anthocyanidins and anthocyanins scavenged efficaciously O₂^(·-), H₂O₂, ONOO^(-) and NO, O₂^(·-) scavenging activity of anthocyanidins and anthocyanins among ROS/RNS tested, exhibited a strong correlation with their cytoprotection. The scavenging of O₂^(·-), which is important because this radical is primarily generated by intracellular redox cycling of Dox, may be crucial for achieving their cytoprotection. Dietary BE supplementation significantly reduced Dox-induced cardiotoxicity, considering its histological protection against Dox-induced myocardial damage. The protective effect of BE resulted from at least in part through the augmentation of creatine phosphokinase (CPK) activity and the reduced glutathione savings in heart tissue. Though the protective potentials of BE against Dox-induced cardiotoxicity was not enough to counteract the toxicity, BE may help to increase the resistance against Dox-induced cardiotoxicity. In conclusion, these results demonstrated that BE may have protective potential against the Dox-induced cardiotoxicity in vitro and in vivo. The protective actions of BE were higly related with induction of CPK activity and the antioxidative properties, especially scavenging of O₂^(·-) generated by redox cycling of Dox and restoring GSH. The data demonstrate that a natural antioxidant, BE may be favorable for the alleviation of cardiotoxicity in patients who receive Dox therapy. Further studies are required to elucidate the discrepancy between in vitro and in vivo results and the effect of BE on chemosensitivity of Dox using tumor-bearing animal model.;항암제인 doxorubicin (Dox)은 그 강력한 항암효과와 다양한 종류의 악성종양에 처방할 수 있는 장점 때문에 널리 사용되어왔다. 그러나 Dox의 사용은 약의 누적용량에 비례하여 치명적인 심장독성을 유발하는 것으로 알려져 있고 이로인해 그 임상적 사용이 제한되고 있다. 이러한 Dox가 심장독성을 유발하는 가장 큰 원인으로는 세포내에서 Dox가 redox-cycling과정을 거치면서 발생되는 oxygen radicals에 의한 산화적 손상때문으로 알려져 있다. 빌베리 안토시아닌 추출물(BE)은 그 강력한 항산화력과 여러가지 다양한 생리적 기능으로 인해 최근 각광받고 있는 기능성 소재식품이다. 따라서 본 실험에서 빌베리 안토시아닌 추출물이 Dox에 의해 유발된 산화적 스트레스를 저해함으로서 심장독성에 대한 보호효과를 나타낼 것으로 예상되었다. H9c2 심장근육세포주를 이용하여 in vitro system에서 BE의 Dox 유래 심장독성에 대한 보호효과를 살펴보았다. H9c2 세포에서 BE가 세포독성 및 사멸에 미치는 영향을 살펴본 결과 BE는 Dox에 의해 유도된 세포독성 및 세포사멸을 감소시켰다. 또한 BE는 Dox에 의해 유도된 MTP를 회복시키고 세포내 ROS 발생을 현저하게 감소시키고 GSH 수준은 증가시킴으로써 심근세포에서 과산화지질의 발생을 감소시켰다. 이러한 결과들로 볼 때, BE는 Dox에 의해 발생되는 산화적 스트레스를 억제함으로서 Dox 유래 심장독성에 대한 보호효과를 나타내는 것으로 사료된다. 순수 안토시아닌을 이용하여 Dox의 심장세포 독성에 대한 안토시아닌의 보호효과를 확인하고 이 보호효과가 안토시아닌의 항산화능과 어떤 관련이 있는지 살펴보았다. 그 결과 aglycone인 안토시아니딘류는 심장세포독성에 대한 보호효과를 나타냈고 그 중 구조상 hydroxyl 기를 많이 가지고 있는 cyanidin과 delphinidin의 활성이 가장 뛰어났다. 그러나 배당체인 안토시아닌류는 보호효과를 나타내지 못했다. 또한 안토시아니딘과 안토시아닌의 자유기 소거능을 시험한 결과 O₂^(·-), H₂O₂, ONOO^(-) 와 NO에 대한 소거능을 보였고, 이 중에서 Dox의 redox cycling에서 발생되는 O₂^(·-)의 소거능과 세포독성에 대한 안토시아닌의 보호효과사이에 유의적인 상관관계가 나타났다. 위의 결과들을 토대로 BE를 식이 보충하였을 때 Dox 유래 심장독성에 대해 동일한 보호효과를 나타낼 수 있는지를 동물실험모델에서 확인하였다. 먼저 Dox를 단회투여한 mouse 모델에서 BE를 10일간 경구투여하였을 때 Dox에 의해 유발된 혈액 독성에 대해 보호효과를 보였다. 또한 한달간 BE를 식이보충하였을 때, Dox에 의해 유도되었던 심근조직의 손상이 유의적으로 회복됨이 관찰되었다. 이러한 BE의 Dox 유래 심장독성에 대한 보호효과는 심장세포내 CPK 효소 활성의 증가 및 GSH 수준의 증가를 통해 이루어지는 것으로 사료된다. 이상의 실험결과들을 볼 때, BE가 함유하는 안토시아닌이 심근세포의 CPK 활성을 높이고 Dox에 의해 유발된 산화적 스트레스를 조절함으로써 Dox의 심장독성에 대한 보호작용을 갖는 것으로 나타났으며, 따라서 BE가 심장독성의 감소를 위한 보조식품으로 사용될 수 있을 것으로 생각된다.