국내 조제분유에 존재하는 Enterobacter sakazakii의 스크리닝 및 특성 분석

Abstract

Enterobacter sakazakii, a bacterium belonging to the family of Enterobacteriaceae, is a motile, non-spore forming, gram-negative, facultative anaerobe rod. Until designated as a new species in 1980, it was known as 'yellow pigmented Enterobacter cloacae'. It is an occasional pathogen of powdered infant formula that can cause rare, but life-threatening disease such as neonatal meningitis, bacteremia, necrotizing enterocolitis(NEC), and necrotizing meningoencephalitis. Although Ent. sakazakii has been isolated from a wide range of foods, powdered infant formula is the source of 50-80% cases of disease induced from Ent. skazakii. For infants not able to breast-feed, infant formula may be the only source of nutrients, therefore it is of utmost importance to be able to investigate contamination of Ent. sakazkii in powdered infant formula. This study was undertaken to screen Ent. sakazakii isolates from powdered infant formulas manufactured in Korea using DFI medium and the isolates were identified with API20E. RAPD-PCR was conducted to genotype among the isolates, then characterizations of Ent. sakazakii isolates by dry stress and pH were performed. As the result of screening Ent. sakazakii from powdered infant formulas, 4/51(8%) Ent. sakazakii were isolated. The isolates were confirmed with 98.4% ID and all biochemical profiles of the isolates were in accordance with Ent. sakazakii KCTC2949, the type strain of Ent. sakazakii. The four Ent. sakazakii isoaltes(Ent. sakazakii KOYC1051, KOYC2051, KOYC2052 and KOYC2053) were genotyped by RAPD-PCR using random primer UBC 245(5'-CGC GTG CCA G-3') and UBC 245 amplified PCR bands ranging from 300 bp to >1,517 bp. The RAPD-PCR profiles of the isolates showed similar banding patterns and they were divided into two clusters(cluster 1: Ent. sakazakii KCTC2949, KOYC1051, KOYC2052, KOYC2053; cluster 2: Ent. sakazakii KOYC2051) with 97% similarity. Under drying condition at 25℃, the stationary phase cells of four Ent. sakazakii isolates were still survived after 30 days with a decrease of 1.7-2.5 log cycles. When the Ent. sakazakii isolates were grown in the BHI broth with pH 7.5, 6.5, 5.0, 3.0, there was a change of the growth curve of the isolates. At pH 7.5 and 6.5, the lag phase was similar to each other, but the growth rate and maximum growth level at pH 6.5 were lower than that at pH 7.5. At pH 5.0, the lag phase was longer compared to pH 7.5 or 6.5, and both the growth rate and maximum growth level at pH 5.0 were lower than those at pH 7.5, 6.5. At pH 3.5, there was no change of growth level after 48 hrs. It was found that Ent. sakazakii isolates from powdered infant formulas manufactured in Korea were moderately resistant at pH 5.0 while these strains were sensitive at pH 3.5.;Enterobacter sakazakii는 Enterobacteriaceae에 속하는 종으로 운동성이 있고, 포자를 형성하지 않으며 그람음성의 통성 혐기성 세균이다. Ent. sakazakii는 조제분유 내에 때때로 존재하지만 신생아나 미숙아들이 이에 감염되면 심한 경우 생명을 위협하는 패혈증, 뇌막염, 뇌염, 균혈증, 괴사성 전장염(NEC) 등을 일으킬 수 있다. Ent. sakazakii의 감염원이나 전염경로에 대해서 아직 정확하게 알려진 바는 없으나 감염 발병의 대부분이 조제분유를 통한 것으로 밝혀졌다. 모유수유를 하지 않는 영아들의 경우, 영양섭취를 전적으로 조제분유에 의존하기 때문에 조제분유에 존재하는 Ent. sakazakii의 오염 정도를 파악하는 일은 매우 중요하다. 이에 본 연구에서는 국내에서 제조된 조제분유들을 대상으로 Ent. sakazakii의 스크리닝을 실시함으로써 국산 조제분유의 오염도 실태를 파악하고자 하며 RAPD-PCR을 통해 표준균주 및 분리균주들의 genotype을 분석하고, 또한 분리균주들의 dry stress 상황에서의 생존 추이 및 pH 조건에 따른 Ent. sakazakii 성장곡선의 변화를 분석하고자 하였다. DFI medium을 이용하여 국산 조제분유에 존재하는 Ent. sakazakii를 스크리닝한 결과, 총 51개 제품 중에서 4개의 Ent. sakazakii 분리균주를 검출하였다. 이들을 API20E로 동정한 결과 98.4%의 동정확률을 갖는 것으로 확인되었으며, Ent. sakazakii KCTC2949와 동일한 biochemical profile을 나타내었다. 4개 분리균주들(Ent. sakazakii KOYC1051, KOYC2051, KOYC2052, KOYC20253)에 대해 random primer UBC 245(5'-CGC GTG CCA G-3')를 이용하여 RAPD-PCR을 한 결과, 300 bp에서부터 >1,517 bp까지 band가 합성되었으며 RAPD-PCR profile은 균주 간에 유사하게 나타났다. 25℃ 건조 상황에서 분리균주들의 생존 추이를 알아본 결과, 30일이 지난 후 약 1.7-2.5 log cycle이 감소하는 것으로 나타났다. 또한 이 분리균주들을 각 pH 7.5, 6.5, 5.0, 3.5에서 배양하면서 성장곡선을 측정한 결과 pH 7.5와 6.5의 lag phase는 서로 간에 큰 차이가 없었으나 pH 6.5에서의 growth rate와 최종 도달하는 maximum level이 pH 7.5에 비해 낮은 것으로 나타났다. 한편, pH 5.0은 pH 7.5, 6.5와 비교해 보았을 때, lag phase가 훨씬 길어졌으며 growth rate와 최종 도달하는 maximum level 또한 낮은 것으로 나타났다. pH 3.5에서는 48시간이 지나도 분리균주들의 growth level에 변화가 없었다. 즉, 국내에서 제조한 조제분유로부터 분리한 Ent. sakazakii 분리균주들은 pH 5.0에 대해서는 moderately acidic resistance를 갖고 있는 반면 pH 3.5에 대해서는 보다 민감하게 반응한다는 것을 알 수 있었다.