면역조직화학적 방법을 이용한 흰쥐의 호모시스테인 수준과 망막 손상의 관련성 연구

Abstract

The elevated plasma homocysteine level has been regarded as an independent risk factor for vascular diseases such as artherosclerosis and cardiovascular disease. Recent epidemiological and clinical data suggest that high homocysteine concentrations promote retinal impairment, but the underlying mechanism is unknown. This study was designed to observe the retinal morphplogical alterations induced by increased plasma homocysteine levels. We investigated the expression of vimentin and glial fibrillary acidic protein (GFAP) within retinal M?ller cells and within astrocytes, respectively using immunohistochemical methods. We also examined the response of vascular endothelial growth factor(VEGF)-induced angiogenesis and vascular hyperpermeability by using immunohistochemical method and immunoblotting. Male Sprague-Dawley rats were raised on an experimental diet containing 3.0g/kg homocystine without folic acid(H) for 2 weeks and then they were placed either on 3.0g/kg homocystine without folic acid(H) or on 3.0g/kg homocystine plus 0.008g/kg folic acid(HF) for 2 and 8 weeks more. At 2 weeks, the homocystine wihout folic acid diet induced an increase in the plasma homocysteine levels and it was associated with the increase in the expression of vimentin in the M?ller cells' processes. The immunoreactivity of GFAP and VEGF was also increased. The disrupted metabolism of reactive oxygen species generation and hypomethylation associated with the toxicities of plasma homocysteine might result in these retinal morphological injuries. At 2 weeks, plasma retinol level and hepatic SAM/SAH ratio were lower in H diet groups than in contol groups. In H diet groups, the levels of TBARS and SAH were increased. At 10 weeks, although the levels of retinol, α-tocopherol, SAM and SAM/SAH ratio were lower and the levels of TBARS and SAH were higher in H diet groups, the immunostaining of vimentin, GFAP and VEGF was similar in the retinas of between control diet groups and experimental diet groups(H and HF groups). In conclusion, plasma homocysteine status seems to have an important role on the morphological and functional change in retinal glial cells. This study may have implications for further investigation of the interaction between increased homocysteine and retinal dysfunction.;본 연구는 식이에 따라 변화되는 혈중 호모시스테인 및 엽산수준이 망막에 미치는 영향을 면역조직화학적 방법을 이용하여 관찰하였다. 평균체중이 278.6±1.4 g인 8주령의 Sprague Dawley종을 대상으로 2주동안 호모시스틴+엽산결핍식이 (3 g/kg diet + 0 g/kg diet, H)를 먹인 후, 다시 같은 식이를 계속 섭취한 군 (H)과 호모시스틴과 엽산을 함께 섭취한 군 (3 g/kg diet + 0.008 g/kg diet, HF)으로 나누어 2주 및 8주동안 더 사육하였다. 사육기간 0, 2, 4, 10주에 실험동물을 희생시켜 혈장의 호모시스테인, 엽산, 비타민 B12 농도 변화를 분석하였다. 식이에 따라 변화되는 혈중 호모시스테인 및 엽산, 비타민 B12 농도가 혈중 항산화 수준에 미치는 영향을 판단하기 위하여 혈중 항산화 비타민 (retinol, α-tocopherol) 영양상태 및 TBARS 수준을 분석하였다. 이러한 식이의 변화가 간에서의 methylation 대사에 미치는 영향을 알아보기 위해서 간의 SAM, SAH 수준 및 SAM/SAH ratio변화를 관찰하였다. 식이에 따른 체내 변화가 망막 손상에 미치는 영향을 분석하기 위해 vimentin, GFAP, VEGF 단백질을 이용하였다. 망막 조직내에서 이 단백질들의 발현 양상을 면역조직화학적 방법을 이용하여 관찰하였고, VEGF 단백질의 경우에는 western blotting실험을 실시하여 발현 여부 및 정도를 측정하였다. 본 연구에서 동일한 사육기간내에 있는 실험동물의 체중증가량과 식이 섭취량은 유의적인 차이가 없었다. 혈장 호모시스테인 농도는 동일한 사육기간내에서 H군이 다른군에 비해 유의적으로 높았다. H군의 경우, 사육기간이 증가할수록 혈장 호모시스테인 농도는 유의적으로 상승했다. 혈장 엽산 농도는 동일한 사육기간내에서 H군이 다른군에 비해 유의적으로 낮았다. 비타민 B12 수준에는 실험동물에서 유의적인 차이가 없었다. 2주 실험동물의 경우, 대조군과 비교하여, H군의 혈중 retinol 수준 및 간조직의 SAM/SAH ratio는 유의적으로 낮았지만, 혈중 TBARS 수준 및 간조직의 SAH 수준은 유의적으로 높았다. 10주 H군의 경우 혈중 retinol, α-tocopherol, SAM, SAM/SAH ratio가 유의적으로 가장 낮았으며, TBARS 및 SAH 수준은 유의적으로 높았다. 식이 변화로 인해서 증가된 혈중 호모시스테인 및 감소된 엽산 수준이 혈중 항산화능 및 간의 methylation 대사기능에 영향을 주었다는 것을 알 수 있었다. 체내 변화가 망막에 미치는 영향을 연구하고자 망막의 M?ller cell 및 M?ller cell 돌기에 반응하는 vimentin, 망막의 astrocytes 및 astrocyte filaments에 반응하는 GFAP, 망막혈관세포에 반응하는 VEGF를 이용하여 면역조직화학적 연구를 실시하였다. 2주 H군의 경우, 망막에서 vimentin, GFAP, VEGF 단백질 발현이 증가하였는데, 호모시스틴 식이로 인하여 체내의 호모시스테인, 엽산, retinol TBARS, SAH, SAM/SAH ratio수준이 변화하여 혈중 ROS 등의 산화적 손상이 유발되고, methylation기전에 손상이 유발되었기 때문인 것으로 사료된다. 10주 H군의 경우, 비록 체내의 호모시스테인, 엽산, retinol, α-tocopherol, TBARS, SAM, SAH 및 SAM/SAH ratio 수준이 좋지 않았더라도, 망막에서 vimentin, GFAP, VEGF 단백질 발현은 2주 H군에 비해서 감소했으며, 대조군 및 HF군의 수준과 거의 비슷한 양상을 띄었다. 망막조직은 혈류이동 및 영양분 교환이 활발한 조직으로, 계속적인 상처에 대해서 재생하려는 기전이 있다는 것을 추측할 수 있었다. 10주 HF군에서의 면역조직학적 발현에서 엽산의 보충효과는 살펴 볼 수 없었다. 본 연구는 여러 혈관질환의 독립인자인 호모시스테인의 상승이 미세조직인 망막에 미치는 영향을 살펴본 연구라는 점에서 의의가 크다. 후행 실험으로 실험동물의 기간을 증가시켜 망막조직의 변화를 더 관찰하고, 상처를 주기전에 엽산을 보충시켜서 엽산의 기능을 파악한다면, 혈중 호모시스테인 및 엽산의 수준이 망막에 미치는 기전에 대한 정확한 규명이 가능할 것이다.