Metabolic engineering of Escherichia coli for the prodution of PHAs by the expression of engineered thiolases

Abstract

Plastics offer various advantages, yet their indiscriminate use poses significant environmental challenges. To address these environmental challenges, extensive research is being conducted on bio-based plastic materials, particularly polyhydroxyalkanoates (PHA). Unlike chemically synthesized polymers like polylactic acid (PLA) and polybutylene succinate (PBS), PHA is naturally produced by microorganisms through metabolic pathways. PHA represents a promising alternative due to its biodegradability and environmentally friendly production process. Thiolase enzymes play a crucial role in PHA production, catalyzing key biochemical processes. Specifically, medium-chain-length PHA (mcl-PHA) is researched for its rubber like properties and flexibility, with Ralstonia eutropha BktB commonly used for its production. However, a thiolase with broader activity is needed for polymers with more than six carbon atoms. Megasphaera sp. MH thiolase shows promise in catalyzing C6 chain condensation, potentially benefiting mcl-PHA production. Thus, our study aims to select a thiolase with broader substrate specificity to enhance monomer molar fractions in polymer synthesis. Mutations on Ralstonia eutropha BktB were conducted alongside thiolase from Megasphaera sp. MH to create an expanded thiolase. As a result, in the production of P(3HB-co-3HHx), the BktB(G246F) mutant produced 33.31wt% P(3HB-co-2.34mol% 3HHx) and the Mhthl(R221K) mutant resulted 52.29wt% P(3HB-co-1.76mol% 3HHx). In the production of P(3HB-co-3HV), BktB(G246F) achieved 45.79wt% P(3HB-co-22.66mol% 3HV), and Mhthl(A319G) resulted in 52.61wt% P(3HB-co-20.28mol% 3HV). We aimed to explore the potential applications of thiolases and validate their utility in the biosynthesis of P(3HB-co-3HV) and P(3HB-co-3HHx), thereby demonstrating the broader applicability of thiolases in metabolic engineering for sustainable biopolymer production.;플라스틱은 여러 가지 장점을 제공하지만, 무분별한 사용으로 인해 심각한 환경 문제를 초래한다. 이러한 환경 문제를 해결하기 위해, 생물 기반 플라스틱 소재, 특히 Polyhydroxyalkanoates (PHA)에 대한 광범위한 연구가 진행되고 있다. Polylactic acid (PLA)나 polybutylene succinate (PBS)와 같은 화학적으로 합성된 폴리머와 달리, PHA는 미생물의 대사 경로를 통해 자연적으로 생산된다. 이러한 이유로 PHA는 생분해성 및 환경 친화적인 생산 공정 덕분에 유망한 대안으로 부각되고 있다. 티올레이즈 효소는 PHA 생산에 있어 중요한 생화학적 과정을 촉매하는 데 중요한 역할을 한다. 특히, 중간사슬길이 PHA(Mcl-PHA)는 고무와 같은 특성과 유연성으로 인해 연구되고 있으며, Ralstonia eutropha 유래의 BktB는 이러한 생산에 흔히 사용된다. 그러나 6개 이상의 탄소 원자를 포함하는 고분자 를 생산하려면 더 넓은 활성 범위를 가진 티올레이즈가 필요하다. Megasphaera sp. MH 티올레이즈는 C6 사슬 축합 반응을 촉매하는 데 유망하여 mcl-PHA 생산에 도움이 될 수 있다고 생각했다. 본 연구는 고분자 합성에서 단량체 몰 비율을 향상시키기 위해 더 넓은 기질 특이성을 가진 티올레이즈를 선택하는 것을 목표 했다. 확장된 티올레이즈를 만들기 위해 Ralstonia eutropha BktB와 Megasphaera sp. MH에서 유래한 티올레이즈를 포함하고 각 효소들의 돌연변이체를 함께 연구했다. 그 결과 P(3HB-co-3HHx) 생산에서 BktB(G246F)는 33.31wt% P(3HB-co-2.34mol% 3HHx), Mhthl(R221K)은 52.29wt% P(3HB-co-1.76 mol% 3HHx) 결과를 보였다. P(3HB-co-3HV) 생산에서는 BktB(G246F)는 45.79wt% P(3HB-co-22.66 mol% 3HV), Mhthl(A319G)은 52.61wt% P(3HB-co-20.28 mol% 3HV) 결과를 보였다. 이를 통해 티올라제의 잠재적 사용법을 탐구하고 P(3HB-co-3HV) 및 P(3HB-co-3HHx) 생산에서의 유용성을 확인함으로써 티올라제의 더 넓은 적용 가능성을 입증하는 것을 목표로 했다.